焦香型乳酸菌饮料的研制

汤木果，陈晓琴，赵存朝,2，陶亮,2,3，田洋,2,3,4

(1.云南农业大学 食品科学技术学院，昆明650201；2.国家辣木加工技术研发专业中心，昆明650201；3.云南省生物大数据重点实验室，昆明650201；4.食药同源资源开发与利用教育部工程研究中心，昆明650201)

0 引言

我国乳酸菌饮料产于上世纪80年代，起因是国内有患有乳糖不耐症的人，不能很好的消化吸收牛乳中的乳糖，乳酸菌饮料的出现很好的解决了上述问题[1]。焦香型乳酸菌饮料是以有机脱脂奶粉为原料，添加还原糖经美拉德反应、接种、发酵、破乳、调配、均质而制成的色、香、味俱全并具有清爽口感、酸甜适中的乳酸菌饮料[2]。焦香型的产生主要是利用添加的葡萄糖与蛋白在高温下发生美拉德褐变反应所致，此反应对饮料的pH值、黏度、离心沉淀率均有影响[3-4]。目前，乳酸菌饮料被认为是一种营养丰富、健康型的饮料[5]。同时，乳酸菌饮料也是近年来在我国快速发展并流行的一类饮料产品[6]，乳酸菌能够增强人体免疫力[7]，主要是因为机体肠道菌群平衡可以促进食物消化[8]，提升机体对营养物质的吸收利用，并且在一定程度上还具有延缓人体衰老等功能[9]。根据中商产业研究院数据可知，乳酸菌饮料在2015年到2019年平均复合增长率是11.2%，截止2019年销售额为364.8亿，预计2020年有望达到389.3亿。中国乳酸菌饮品市场需求较高，前景广阔。

随着人们健康意识的不断提升，乳制品行业竞争越发激烈，为了满足当前消费者对于“营养、健康、安全、好喝、时尚”的含乳饮品的追求，开发一款焦香型乳酸菌饮料，不仅可以丰富乳酸菌饮料制品的产品种类，相较于其他乳酸菌饮料，其具有健康、营养、好喝、易消化，且适合各个年龄阶段人饮用。目前，国内外已有水果发酵酸乳、谷物蛋白发酵饮料等的研究，但焦香型乳酸菌饮料的研究较少。本研究以有机脱脂奶粉为主要原料研发一款口感清爽、酸甜适中且健康的焦香型乳酸菌饮料，这不仅可以丰富乳酸菌饮料产品品类，也可为乳酸菌饮料的实际生产提供一定的理论以及技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

有机脱脂奶粉，天津银河伟业进出口有限公司；食用葡萄糖、白砂糖，景谷洋浦南华糖业有限公司；大豆多糖（B20170815）、（B20190515）、复配增稠乳化剂（HBT-A7301）、（HBT-A8355）、（HBT-A8570）、（HBT-A5352），福建省泉州市味博食品有限公司；土耳其菌种、OELVO-YORMY-1821、FD-DVS A BY-8/25X 200U、DELVO-YOGRFVV-231、CHN-22、乳酸菌kT-A8，北京正洺嘉科科贸有限公司；YFL922、R-707、YoFLexRMild 1.0、mo-30、HarrestLB-1，科汉森菌种生物科技公司。

1.2 仪器与设备

DHP-500电热恒温培养箱，北京市永光明医疗仪器有限公司；HJJ-6水浴恒温电动搅拌器，常州华奥仪器制造有限公司；p HS-3C雷磁p H计，上海仪电科学仪器股份有限公司；YP5001电子分析天平，上海光正医疗仪器有限公司；60-6S高压均质机，上海东华高压均质机厂；旋转式黏度计，旋转式黏度计。

1.3 方法

1.3.1 焦香型乳酸菌饮料制作工艺流程

有机脱脂奶粉溶解→溶解葡萄糖→美拉德反应→降温、接种→低温长时发酵→破乳→加入稳定剂、白砂糖、乳酸→混匀→过滤→均质→分瓶→杀菌→分段冷却→焦香型乳酸菌饮料

1.3.2 操作要点

（1）有机脱脂乳粉溶解：将有机脱脂奶粉溶于45～48℃蒸馏水中，按料液比1∶10(w/v)溶解，低温不易溶解，易发生团聚，高温使乳清蛋白发生凝固变性。

（2）稳定剂添加：先将物料混匀，水加热至沸腾，在搅拌的同时加入物料，搅拌到完全溶解为止。时间控制在30 min。

（3）均质：均质是乳酸菌饮料沉淀的一种有效的物理方法，也是生产中口感是否细腻至关重要的一步。均质压力为20～25 MPa。

（4）杀菌：在85℃条件下杀菌30 min，既要保证充分杀菌，又不能影响焦香型乳酸菌饮料的质地及风味。

（5）接种发酵：接种0.2%菌种发酵液，在4℃下发酵48 h，进一步促进焦香型乳酸菌饮料的形成及产酸产香。

（6）冷藏：在4℃条件下冷藏，进一步产酸产香，完善乳酸菌饮料风味和滋味。

1.3.3 美拉德反应条件的筛选及葡萄糖添加量的确定

以感官评分为参考指标，考察美拉德反应条件（温度/时间：90℃/60 min、90℃/90 min、100℃/90 min、100℃/120 min、120℃/90 min、120℃/120 min）及葡萄糖添加量（5%、10%、15%、20%、25%）。

1.3.4 菌种筛选

在优选的美拉德反应温度、时间和葡萄糖添加量的基础上，以感官评分、pH值为指标，对直投式乳酸菌种（鼠李糖乳杆菌、乳酸菌k T-A8、土耳其菌种、乳酸菌CHN-22、乳酸菌1821DSL、Mild 1.0菌种、YFL904菌种、R-707菌种）进行筛选。

1.3.5 单因素试验及响应面优化试验

以感官评分、p H值及酸度为分析指标，考察菌种接种量（%）、乳酸添加量（%）、发酵时间（h）、白砂糖添加量（%）和稳定剂种类及复配稳定剂添加量（%）对焦香型乳酸菌饮料的影响；在试验过程中发现乳酸添加量（%）、白砂糖添加量（%）对焦香型乳酸菌饮料影响不大；后期优化试验以菌种接种量（%）、发酵时间（h）和复配稳定剂添加量（%）为自变量，以感官评分、p H值及酸度为响应值，通过响应面试验优化焦香型乳酸菌饮料最佳工艺配方。焦香型乳酸菌饮料优化试验因素与水平如表1所示。

表1响应面优化试验的因素及水平

1.3.6 产品指标检测

1.3.6.1 焦香型乳酸菌饮料感官评定。

选择10名具有一定感官评定经验的专家对焦香型乳酸菌饮料的色泽（25分）、口感（25分）、滋味与香气（25分）、组织状态（25分）4个方面进行感官评定。每个品评员对每个样品重复评价3次，取平均值即为感官评分结果。感官评分标准见下表2。

表2焦香型乳酸菌饮料的感官评分标准

1.3.6.2 产品理化指标测定

（1）焦香型乳酸菌饮料p H测定。

p H计进行校准后测量焦香型乳酸菌饮料p H。

（2）焦香型乳酸菌饮料的沉淀率测定。

参考朱彤[10]等方法并稍作修改。称取30 m L焦香型乳酸菌饮料样品，4 000 r/min离心20 min，缓慢倒出上清液，然后将离心管倒置30 min后测量离心管底部沉淀量，记为M 1，沉淀率计算公式如下。

式中：M1为离心管倒置30 min后测量离心管底部沉淀量；M2为离心管质量；M为样品质量。

（3）黏度的测定。

使用校正后的旋转式黏度计进行测定3次，结果取平均值。

（4）其他指标测定。

酸度、乳酸菌活菌数、菌落总数、霉菌、酵母、大肠菌群的测定：参照GB/T 21732《食品安全国家标准含乳饮料》中相关方法检测。

1.4 数据统计与分析

采用Excel 2013、SPSS 24对实验数据进行整理及统计分析，利用Design-Expert10.0.1进行响应面分析。

2 结果与讨论

2.1 美拉德反应条件对美拉德反应程度的影响

2.1.1 温度/时间对美拉德反应程度的影响

有机脱脂奶粉中的蛋白质等氨基化合物和葡萄糖或其他羰基化合物之间在正常的状态下并不会发生美拉德反应，只有当温度较高、反应时间较长时才发生明显的美拉德反应[10]。美拉德反应使产品具有特殊的色泽和风味[11]。本试验筛选温度/时间及葡萄糖添加量，通过产品的颜色深浅比较其美拉德反应程度，通过色泽和风味的感官评定，确定最适的温度/时间和糖用量。

根据试验发现不同美拉德反应条件对焦香型乳酸菌饮料的感官品质有显著影响。在葡萄糖添加量为20%的条件下，考察温度/时间对焦香型乳酸菌饮料的影响。在如图1所示，感官评分最高的美拉德反应条件是100℃/90 min，焦香型乳酸菌饮料呈现褐色颜色适中，有浓郁的焦香味，口感润滑，无乳清析出，感官评分可达87分，最低的是120℃/120 min，呈现褐色颜色偏深，有异味，口感稀薄略粗糙，有乳清析出。研究表明温度太低、时间太短，反应较难进行完全，风味物质难以呈现出来；但温度过高、时间过长，会引起焦糖化反应，产生不良风味，甚至蛋白质及其他易变性成分会越严重[12]。根据焦香型乳酸菌饮料的组织状态、口感、风味、感官评分综合分析，确定100℃/90 min为焦香型乳酸菌饮料最佳美拉德反应条件。

图1焦香型乳酸菌饮料美拉德反应条件筛选结果

2.1.2 葡萄糖添加量对美拉德反应程度的影响

还原性糖是美拉德反应中不可少的一类物质，葡萄糖属于还原性糖，可以供给能力及补充体内糖分，并且直接参与人体的代谢过程[13]。且葡萄糖添加量会直接影响乳酸菌的口味和色泽。在温度/时间为100℃/90 min的条件下，考察葡萄糖添加量对焦香型乳酸菌饮料的影响。

图2葡萄糖添加量对美拉德反应程度的影响

从图2可知，随着葡萄糖添加量的增多，感官评分呈现先升高后下降的趋势，产品颜色越来越深。当葡萄糖添加量为20%时，感官评分最高，此时产品色泽适宜，呈褐色，有独特的焦香味，酸甜可口；当添加量超过20%时，口感太甜，酸味明显不足，感官评分出现下降。所以选用20%的葡萄糖添加量为最佳工艺参数。

2.2 菌种筛选

发酵菌种对乳酸菌饮料的质量品质有至关重要的作用，对饮料的风味品质、组织形态均有重要影响[14]。本试验研究了11种发酵菌种对焦香型乳酸菌饮料的感官品质和p H的影响。

图3焦香型乳酸菌饮料发酵菌株筛选结果

如图3所示，感官评分最高的菌株是FDDVSABY-8/25X 200U，p H值约为3.7，呈现组织状态均匀一致、不分层、微量乳清析出，色泽均匀，口感及风味较好。感官评分最低的菌株是R-707，p H值约为3.9，呈现质地不均匀，分层、乳清析出，口感及风味差。最终根据乳酸菌饮料的组织状态、口感、风味、感官评分和p H值综合分析筛选后，选定感官评分最高、口感及风味较好、p H值适宜的直投式FD-DVS ABY-8/25X 200U为焦香型乳酸菌饮料最佳发酵菌株。

2.3 单因素试验结果

2.3.1 发酵时间和菌种接种量对感官评分、酸度和p H值的影响

根据焦香型乳酸菌饮料加工工艺流程及操作要点，筛选发酵时间(0、12、24、36、48、60h)和菌种接种量(0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%)对焦香型乳酸菌饮料感官评分、酸度和p H值的影响，结果如图4所示。

图4发酵时间（a）、菌种接种量（b）对焦香型乳酸菌饮料感官评分、酸度和pH值的影响

由图4（a）可知，在菌种接种量为0.2%，乳酸添加量为0.25%，白砂糖添加量为3.5%及复配稳定剂为大豆多糖（B20170815）：复配增稠乳化剂（HBT-A7301）其添加量为6%∶2%条件下，考察发酵时间对焦香型乳酸菌饮料的影响。随着发酵时间的延长，p H值呈现逐渐降低、酸度逐渐上升趋势，感官评分呈现先升高后下降的趋势。当发酵时间在48 h时，感官评分最高，达到85.0分。因此，确定发酵时间为48 h为宜。

在发酵时间为48 h，乳酸添加量为0.25%，白砂糖添加量为3.5%及复配稳定剂为大豆多糖（B20170815）∶复配增稠乳化剂（HBT-A7301）其添加量为6%∶2%条件下，考察菌种接种量对焦香型乳酸菌饮料的影响。由图4（b）可知，焦香型乳酸菌饮料的感官评分随着菌种接种量的增加呈现先升高后下降，p H值呈现逐渐下降、酸度呈现逐渐上升趋势。当菌种接种量在0.20%时，焦香型乳酸菌饮料的感官评价最好，平均得分为85.0分。当菌种接种量添加过少，发酵不成功，产生异味、黏稠度不高，口感淡等，菌种接种量添加过多造成酸度过高。因此，菌种接种量为0.20%最佳。

2.3.2乳酸添加量及白砂糖添加量对感官评分、酸度和p H值的影响

根据焦香型乳酸菌饮料加工工艺流程及操作要点，筛选乳酸添加量(0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%)和白砂糖添加量0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%)对焦香型乳酸菌饮料感官评分、酸度和p H值的影响，结果如图5。

图5乳酸添加量（a）、白砂糖添加量（b）对焦香型乳酸菌饮料感官评分、酸度和pH值的影响

乳酸能调节酸度、口感、提高货架期、抑制细菌生长繁殖，使产品口味柔和爽口，与此同时使产品色泽、质量也得到保障[15]。由图5（a）可知，发酵时间为48 h，乳酸菌种接种量为0.2%，白砂糖添加量为3.5%及复配稳定剂为大豆多糖（B20170815）：复配增稠乳化剂（HBT-A7301）其添加量为6%∶2%条件下，考察乳酸添加量对焦香型乳酸菌饮料的影响。随着乳酸添加量的增加，饮料的p H值逐渐降低、酸度逐渐上升，感官评分呈现先升高后下降趋势。当乳酸菌添加量在0.25%时，焦香型乳酸菌饮料的感官评分最高，p H值为3.88，酸度为100°T。当乳酸添加量添加过少，酸度不够，乳酸添加量添加过多造成酸度过高。因此，乳酸添加量为0.25%最佳。

由图5（b）可知，发酵时间为48 h，菌种接种量为0.2%，乳酸添加量为0.25%及复配稳定剂为大豆多糖（B20170815）∶复配增稠乳化剂（HBT-A7301）其添加量为6%∶2%条件下，考察白砂糖添加量对焦香型乳酸菌饮料的影响。随着白砂糖添加量的增加，产品pH值逐渐降低、酸度逐渐上升，感官评分呈现先升高后下降趋势。当白砂糖添加量为3.5%时，焦香型乳酸菌饮料的感官评分最高，p H值为4.1、酸度为98°T。当白砂糖添加量添加过少，酸味重，口感差，白糖添加量添加过多造成甜味过重，口感不细腻有杂质感。因此，白砂糖添加量为3.5%最佳。

2.3.3 稳定剂种类及添加量对感官评分、酸度和p H值的影响

体系稳定是乳酸菌饮料质量的重要评价指标[16]。因此选择合适的稳定剂种类以及添加量对乳酸菌饮料产生重要影响[17]。本试验对稳定剂种类及添加量进行筛选。

图6稳定剂种类（a）对焦香型乳酸菌饮料感官评分及稳定剂添加量（b）对焦香型乳酸菌饮料感官评分、酸度和pH值的影响

从图6（a）可以看出大豆多糖（B20170815）和复配增稠乳化剂（HBT-A7301）的感官评分最高，最低的是复配增稠乳化剂HBT-A8355。曾研究报道大豆多糖与复配增稠乳化剂混合使用效果均较二者单独使用更佳[18]。因此本研究以感官评分最高的大豆多糖（B20170815）和复配增稠乳化剂（HBT-A7301）作为复配稳定剂制作焦香型乳酸菌饮料。

由图6（b）可知，发酵时间为48 h，菌种接种量为0.2%，乳酸添加量为0.25%及白砂糖添加量为3.5%条件下，考察大豆多糖（B20170815）与复配增稠乳化剂（HBT-A7301）添加量对焦香型乳酸菌饮料的影响。感官评分最高的大豆多糖（B20170815）与复配增稠乳化剂（HBT-A7301），其添加量为6%∶2%，p H值为4.03、酸度约为93°T，感官评分最低的大豆多糖（B20170815）与复配增稠乳化剂（HBT-A7301）其添加量为8%∶8%。当复配稳定剂添加量添加过少，出现沉淀分层或脂肪上浮，稳定剂添加量过多造成口感差。因此，大豆多糖（B20170815）与复配增稠乳化剂（HBT-A7301）添加量为6%∶2%最佳。

2.4 响应面试验结果与分析

2.4.1 响应面试验设计及结果分析

在单因素基础上，优化试验以菌种接种量（%）、发酵时间（h）和复配稳定剂添加量（%）为自变量，以感官评分、p H值及酸度为响应值，利用响应面进行3因素3水平试验设计，试验方案及结果见表3，回归分析见表4~5。

表3试验设计与结果

2.4.2 模型建立及显著性检验

利用Design-Expert 10.0.1软件对实验数据进行统计分析，得到二次多项式回归方程：

方差分析结果见表4~5。

表4酸度和pH值回归方程的方差分析结果

(续表4)

表5感官评分回归方程的方差分析结果

对回归方程进行方差分析如表4~5所示。模型显著性检验P＜0.05，失拟项不显著，说明该模型具有统计学意义。从表4可以看出，工艺条件对酸度的影响大小顺序为：A＞B＞C，即菌种接种量＞发酵时间＞复配稳定剂添加量。模型的决定系数R2为0.9813，R2adj=0.9572，表明模型具有较高的拟合及预测精度；工艺条件对p H值影响大小顺序为：B＞C＞A，即发酵时间＞复配稳定剂添加量比例＞菌种接种量。模型的决定系数R2为0.9804，说明模型具有高的显著性，而R2adj=0.9551，能够解释实验95.51%的响应值变异，说明此实验模型与真实数据拟合程度良好；同理，由表5可知，工艺条件对感官评分的影响大小顺序为：C＞A＞B，即复配稳定剂添加量比例＞菌种接种量＞发酵时间。模型的决定系数R2为0.9759，R2adj=0.9450，表明模型具有实践指导意义。综上，可以用上述模型来分析和预测p H值、酸度、感官评分的最优工艺。

2.4.3 最佳条件的确定和回归模型的验证

根据此回归方程，通过响应面法得到最优焦香型乳酸菌饮料工艺条件为取菌种接种量为0.18%、发酵时间为39.5 h、稳定剂为大豆多糖B（B20170815）：复配增稠乳化剂（HBT-A7301），添加量为8%∶4%。此条件进行3次重复试验，得平均p H值为3.73、平均酸度为104°T、平均感官评分89分，与模型预测结果吻合，表明基于该响应面模型分析优化菌种接种量、发酵时间、复配稳定剂添加量的方法有效可行。

2.5 焦香型乳酸菌饮料的产品质量指标测定

由表6可知，制备的焦香型乳酸菌饮料沉淀率为5.527%，酸度为104°T，p H值为3.73，焦香型乳酸菌饮料呈现出沉淀率较低、组织细腻、质地均匀的状态，其中黏度直接影响焦香型乳酸菌饮料产品的口感[19]，黏度越低，口感越清爽，与李海燕[19]等研发的低糖褐色乳酸菌饮料（黏度为35 mPa·s）相比，本试验黏度为33.4 mPa·s，说明本产品黏度更低一些，口感更为清爽。乳酸菌活菌数为1.0×107CFU/m L，大肠菌群、菌落总数、霉菌、酵母及致病菌未检出，符合国家标准。与其他乳酸菌饮料相比，焦香型乳酸菌饮料酸含量高、更易消化、吸收，具有焦香味道且黏度低，口感更为清爽，赋予饮料特殊的香气和口感。

表6焦香型乳酸菌饮料的理化特性

3 结论

基于美拉德反应制作出焦香型乳酸菌饮料，其美拉德工艺条件为100℃/90 min、葡萄糖添加量为20%，产品的褐色适中，焦香味显著，风味独特，符合消费者的要求。焦香型乳酸菌饮料加工的最佳发酵剂菌种为直投式FD-DVS ABY-8/25X 200U菌种，菌种接种量为0.18%、发酵时间为39.5 h、复配稳定剂为大豆多糖（B20170815）：复配增稠乳化剂（HBT-A7301），其添加量为8%∶4%的条件下制得的焦香型乳酸菌饮料酸甜可口，颜色呈褐色，沉淀率为5.527%，黏度为33.4 mPa·s，酸度为104°T，p H值为3.73，乳酸菌活菌数为1.0×107CFU/mL，大肠菌群、菌落总数、霉菌、酵母及致病菌未检出，开发的焦香型乳酸菌饮料是一款口感清爽，色泽风味浓郁的焦香型乳酸菌饮料，具有一定的市场前景，同时乳酸菌饮料产品的开发对乳酸菌产业发展也具有一定的推动意义。