基于网络药理学的雷公藤干预Graves眼病潜在靶点预测及作用机制分析

张国玉

内黄县中医院，河南 内黄 456300

Graves眼病(graves ophthalmopathy，GO)又称浸润性突眼、甲状腺相关性眼病，是格雷夫斯病(graves disease，GD)的甲状腺外并发症，占GD的25%～50%[1]。GO患者以眼内异物感、胀痛、畏光、流泪、复视、视力减退为主要症状，严重者因眼睑闭合不全、角膜外露而形成角膜溃疡、全眼炎，甚至失明，不仅影响患者的生活质量，还对外貌及心理状况产生巨大影响[2]。糖皮质激素是治疗Graves眼病的主要方法，尤其是对活动性中重度患者。雷公藤素有“中草药激素”之称，一项荟萃分析表明，雷公藤有效提取物雷公藤多苷治疗该病疗效显著，且不良反应较少[3]。网络药理学融合了医学、计算生物学、生物信息学、网络分析等多学科，实现从药物成分到疾病靶点、基因、途径的综合网络分析，阐述药物对疾病的作用机制。本研究采用网络药理学方法分析雷公藤治疗Graves眼病的作用机制，希冀为雷公藤制剂治疗Graves眼病的基础实验研究及临床研究提供方向和理论。

1 材料与方法

1.1 雷公藤相关靶点筛选通过中医药系统药理学平台[4]寻找雷公藤化学组成成分，根据口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%[5]、类药性(drug-likeness，DL)≥ 0.18[6]的2个药代动力学属性值进行活性成分初步筛选，以获得活性化合物及活性成分的预测蛋白质靶点。筛选结束后，在Uniprot蛋白质数据库(https：//www.uniprot.org)将活性成分预测的蛋白质靶点进行规范。

1.2 Graves眼病相关靶点筛选以“Graves Ophthalmopathy”为疾病名，挖掘GeneCards数据库(https：//www.genecards.org)中与Graves眼病相关的基因。在Genecards数据库中，Score值越高，表示该靶点与疾病联系越密切。根据经验，多设定Score大于中位数的靶点为潜在靶点[7]。在OMIM数据库(http：//www.omim.org)、TTD数据库(http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)、DisGeNET数据库(https：//www.disgenet.org/home/)中以“Graves Ophthalmopathy”为疾病名获得疾病靶点予以补充。剔除重复值后，获得Graves眼病靶点基因。

1.3 靶蛋白互相作用网络构建为明确雷公藤相关靶点与Graves眼病靶蛋白之间的相互作用，利用Venn在线作图(http：//www.bioinformatics.com.cn/)筛选出二者交集靶点并绘制韦恩图。进而将交集靶点在STRING平台(https：//string-db.org/)构建靶蛋白互相作用(protein-protein interaction,PPI)网络模型[8]，将蛋白种类设置为“Homo sapiens”进行操作，最低相互作用阈值设为“medium confidence=0.4”，其他参数保持默认设置，得到PPI网络。并通过 CytoScape3.7.2软件的分析功能进行研究[9]。

1.4 基因本体(gene ontology,GO)富集分析和京都基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析为了说明雷公藤活性成分的靶点蛋白在基因功能中的作用及在信号通路中的作用，本研究采用David 6.8数据库[10-11](https：//david.ncifcrf.gov/)对韦恩图中的交集靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

1.5 雷公藤成分-Graves眼病靶点-通路网络图的构建运用 CytoScape 3.7.2构建雷公藤成分-Graves眼病靶点-通路网络图，利用CytoScape 3.7.2软件的“Network Analysis”功能分析有效成分及靶点的网络拓扑参数，包括连接度(degree)、介度(betweenness)及紧密度(closenesss)等，并根据网络拓扑学参数判断核心靶点及发挥药效的主要活性成分。

1.6 分子对接验证分析雷公藤的主要活性成分和主要靶点，对其进行分子对接验证。查找或者化学绘图制作活性成分的mol2文件，查找靶蛋白PDB ID。应用SYBYL-X2.0分子对接软件将靶点与活性成分进行对接，根据Total Score评价靶点与活性化合物的结合度。

2 结果

2.1 雷公藤活性成分靶点的获取通过检索TCMSP数据库，共检索到活性成分144个，根据药代动力学属性值OB、DL筛选到活性成分51个，删除无疾病预测靶点活性成分23个，共获得活性成分28个，具体见表1。在TCMSP数据库中共获得靶点143个。

表1 雷公藤主要成分

2.2 Graves眼病靶点的获取从Genecards数据库获得Graves眼病靶点294个。根据经验设定Score大于中位数的目标靶点为其潜在靶点，如通过GeneCards所得Graves眼病靶点Score最大值为55.59，最小值为0.26，中位数为2.79，故设定 Score>2.79的靶点为Graves眼病的潜在靶点。结合OMIM、DisGeNET、TTD数据库补充相关靶点，合并后删除重复值，最终得到150个Graves眼病靶点。

2.3 网络构建结果将筛选的雷公藤活性成分靶点与Graves 靶点成分利用Venn在线作图绘制韦恩图，具体见图1，并得到交集靶点19个。将19个交集靶点在STRING平台，构建靶蛋白相互作用网络图，导出TSV文件，导入CytoScape 3.7.2软件，进行无向、无自身网络分析：该网络共有18个节点(1个未参与)，107条边，网络平均邻节点数为11.889。利用该19个交集靶点逆向反推雷公藤活性成分，制作xls格式文件，导入CytoScape 3.7.2软件，得到雷公藤活性成分-靶点-疾病网络，见图2。根据度值和介数指标，筛选出关键靶蛋白(PTGS2、ADRB2、NR3C1、PPARG、BCL2)，提示这些蛋白在雷公藤药理机制中发挥关键作用，其中PTGS2在网络中的连接度为23，介度为0.301 5，紧密度为0.671 9，预测PTGS2为雷公藤治疗Graves眼病的最主要靶点。

图1 雷公藤成分-Graves眼病靶点韦恩图

注：紫色菱形代表雷公藤，粉红色矩形为雷公藤的活性成分，浅蓝色六边形为蛋白靶点，深蓝色为Graves眼病；节点的面积代表其度数大小

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析应用David 6.8数据库对韦恩图中交集靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能分析：根据错误发现率(false discovery rate，FDR)<0.05，共得到分子功能条目2个，为细胞因子活性、生长因子活性；细胞组分条目3个，为质膜外侧、细胞外间隙、细胞表面；生物过程条目50个，包含炎症反应、免疫应答、白细胞黏附、氧化氮生物合成过程正调控、MAP激酶活性正调节、蛋白质磷酸化正调节等。KEGG通路富集分析共富集出39条通路与雷公藤改善Graves眼病的功效相关，根据 FDR<0.05共得到30条通路，主要包括核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信号通路、细胞黏附分子、Toll样受体信号通路、TNF信号通路、TGF-β信号通路等，具体可见图5。Kappa值表示两个相关对象吻合率，在David 6.8数据库中Kappa分0.75～1.00表示相关性非常高，0.50～0.75表示相关性高，0.25～0.50表示相关性中等，小于0.25表示相关性低，予以舍去。以分子功能细胞因子活性、生长因子活性、细胞组成质膜外侧、细胞外间隙、细胞表面与其他GO富集数据、KEGG富集数据kappa值为依据，舍去相关性低的数据，取5者交集数据，并满足 FDR<0.05，GO富集分析见图3，KEGG分析见图4。

图3 雷公藤改善Graves眼病的GO富集分析条形图

图4 雷公藤改善Graves眼病的KEGG分析气泡图

2.5 雷公藤成分-Graves眼病靶点-通路网络图的构建运用CytoScape 3.7.2构建雷公藤成分-Graves眼病靶点-通路网络，见图5。通过 CytoScape 3.7.2分析，得到核心成分和靶点。CytoScape网络分析表明，雷公藤甲素连接度(degree)为12，介度(betweenness centrality)为0.1669，紧密度(closeness centrality)为0.5317，预测雷公藤甲素为雷公藤治疗Graves眼病的主要成分，其次为山柰酚、川陈皮素、β-谷甾醇、3-(5，8-二羟基-2-氧代苯并吡喃-7-基)-2-羟基-5-甲基苯并吡喃-4-酮、异落叶松脂素，具体见表2。PTGS2、TNF在网络中的连接度为26，预测其为雷公藤改善Graves眼病的最主要靶点。IFNG、TGF-β1、CD40、CD86等亦为相对重要的靶点，具体见表3。

表2 雷公藤主要活性成分网络节点特征参数

表3 靶点蛋白网络节点特征参数

注：粉红色矩形为雷公藤的活性成分，浅蓝色六边形为蛋白靶点，绿色三角形为通路；节点的面积代表其度数大小

2.6 分子对接SYBYL性能稳定、专业度高，为分子模拟和药物设计的首选工具。SYBYL使用原型分子表示结合口袋，小分子配体探测蛋白口袋的疏水、氢键、静电，形成蛋白质活性口袋的负像，通过氢键受体和供体、疏水位置匹配进行打分，分值越大，表示结合作用越好，一般认为，评分≥4分表示存在结合作用，≥6分有较好活性[12]。雷公藤的主要活性成分为雷公藤甲素、山柰酚、川陈皮素和β-谷甾醇，主要靶点为PTGS2、TNF、IFNG、TGF-β1、CD40、PPARG、ICAM1，对其活性成分和靶点进行分子对接验证。结果显示，评分≥4分者占总数92.9%，≥6分者占32.1%，即大部分靶点与成分存在结合活性，分子对接结果见图6。

图6 分子对接结果

3 讨论

中药材雷公藤为卫矛科植物雷公藤的根、叶及花，具有祛风除湿、活血通络、消肿止痛、杀虫、消炎、解毒的功效。临床上多种雷公藤制剂，如雷公藤片、雷公藤总萜片、雷公藤双层片、雷公藤多苷片，在类风湿性关节炎、肾病综合征等自身免疫性疾病中应用广泛。雷公藤成分-靶点-Graves眼病网络显示了引起Graves眼病的靶点众多，靶点之间关系复杂。因此，针对中药多成分、多靶点和复杂的发病机制特点，采用网络药理学分析有利于从分子水平阐明其作用机制。Graves眼病是免疫细胞和成纤维细胞相互作用，形成交叉的免疫反应，产生的抗TSHR、IGF-1R自身抗体使成纤维细胞活化并分泌各种细胞因子，如干扰素γ(interferon，IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-6(interleuki-6，IL-6)、IL-8、IL-10等，从而导致免疫细胞进一步聚集和活化[13]。雷公藤成分-靶点-Graves眼病网络与雷公藤成分-Graves眼病靶点-通路网络均显示雷公藤甲素、山柰酚、川陈皮素、β-谷甾醇为改善Gravse眼病的主要成分。燕树勋等[14]实验证明了雷公藤甲素抑制眼球后成纤维细胞的增生，抑制IFN-γ诱导的CD40的表达。NF-κB调节着TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1β和其他细胞因子的表达[15]。雷公藤甲素还可抑制转录因子NF-κB活性[16]，抑制TNF-α的表达[17]。山柰酚作为膳食抗感染剂被研究[18]，在啮齿类动物非特异性急性炎症中，β-谷甾醇被证明具有较强的抗感染能力[19]，川陈皮素能够通过抑制TGF-β1来抑制成纤维细胞的生长和纤维化[20]。因此雷公藤可能主要通过雷公藤甲素、山柰酚、川陈皮素、β-谷甾醇等改善Graves眼病。

本研究结果表明，雷公藤改善Graves眼病的靶点主要集中在前列素内环氧化物合成酶2(prostaglandin endoperoxide synthase2 PTGS2)、TNF、干扰素γ、TGF-β1、CD40、氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)、 细胞黏附分子1(cell adhesion molecule 1，CAM1)。PTGS2又称COX2，在正常组织细胞内的活性极低，在炎症细胞中的表达水平较高，引起炎症部位PEG2含量的增加，导致炎症反应和组织损伤。Graves眼病患者眼眶组织炎性因子的释放增多，增加纤维细胞的浸润并增加PGE2的释放，PGE2又可以通过增加血管的通透性而进一步加重病情，塞来昔布作为COX2抑制剂，可以抑制PGE2的释放，改善患者的局部症状和体征[21]，同时也拮抗PPARγ。PPARG与Graves眼病患者眼眶部的脂肪增殖、分化相关，将PPARγ激动剂噻唑烷二酮类 (罗格列酮)作用于患者部眼眶成纤维细胞，能刺激脂肪细胞的分化和TSHR的表达[22]。而抑制PPARγ途径则减少人体前脂肪细胞分化和细胞内的脂质积累，减少眼眶部脂肪增殖，延缓病情进展[23]。TGF-β能促进成纤维细胞的生长，TGF-β1在分子水平上促使Graves眼病患者眼眶组织成倍增多，引起纤维化症状[24]，Li等[25]通过抑制TGF-β1而减轻眼眶细胞的纤维化。眼眶成纤维细胞受IFN-γ的刺激而上调表达CD40，启动CD40-CD40L信号通路，刺激眼眶成纤维细胞高表达ICAM-1，而高表达ICAM-1的成纤维细胞因受黏附作用而促进炎症发生[26]。

由雷公藤成分-Graves眼病靶点-通路网络可知，NF-κB信号通路为主要的信号通路之一，是免疫和炎症反应的基础[27]。活性氧可以释放TNF-α、IL-1、TNF-α、IL-6，刺激NF-κB，使病情进展[28]，而糖皮质激素则抑制NF-κB通路，起到改善病情的作用。

雷公藤改善Graves眼病的KEGG分析显示，其作用通路与炎症性肠病通路关系密切。炎症性肠病是感染性微生物和免疫系统失调引起的胃肠道慢性炎症，肠腔的环境最为关键，微生物成分如鞭毛蛋白、肽聚糖和脂多糖可被TLR识别触发NF-κB的激活，导致炎症反应[29]。而肠腔环境的变化，与甲状腺疾病的发生同样密切相关，如甲状腺功能亢进患者的双歧杆菌和乳杆菌明显减少，肠球菌增加[30]。炎症性肠病通路有Th17细胞参与，Th17细胞在Graves眼病的发生、发展中同样发挥着重要作用，Fang等[31]研究表明，疾病在活动期时Th17细胞数量增多，伴随着病情的缓解，Th17细胞数量逐渐下降。Graves眼病同样与TLR信号通路关系密切，推测Graves眼病的发病与肠道微生物关系密切，具体机制仍需进一步研究。

研究结果表明，雷公藤的一种活性成分可以调控多个靶点，而同一靶点可干预多种生物过程及信号通路，体现了雷公藤多靶点、多通路的联合作用。提示雷公藤的活性成分可通过重要靶点对网络进行全部或者局部调节，起到改善Graves眼病的作用，同时预测了雷公藤通过调控肠道微生物改善Graves眼病的潜在作用机制。由于网络药理学的局限性以及中药成分进入人体后反应的复杂性，仍需后续进行动物或细胞实验加以验证。