罗汉果籽蛋白的提取及功能特性研究

刘 畅，张东艳，邓珍菊，刘本国，张 浩

河南科技学院 食品学院，河南 新乡 453003

罗汉果(Momordicagrosvenori)为葫芦科，是广西壮族自治区特色药用植物资源，亦是国家首批批准的药食两用植物之一，其营养价值高，富含维生素C，主要医用价值有润肠肺、止咳化痰、缓解便秘等，同时还具备增强免疫力、抗氧化、护肝、预防龋齿等新型药学作用。研究者在罗汉果化学组成、天然甜味剂分离以及药理机制等方面做了大量的工作[1]。对于罗汉果的系统性研究始于20世纪90年代。迄今，已从罗汉果果实中分离并鉴定出11种葫芦烷三萜苷，此类化合物为果实中的主要活性物质，约占干果质量的4%。除少数活性物质为无甜味(如罗汉果苷Ⅳ)或苦味(如罗汉果新苷)外，大多数为甜味或微甜物质[2]。葫芦烷三萜苷可作为甜味剂用于食品，是糖尿病人理想的甜味代用品[3]。随着对罗汉果的研究深入进行，其加工市场逐渐被打开。目前市售的罗汉果加工产品包括罗汉果复合饮料[4]、罗汉果酸奶、罗汉果代糖等[5]。但伴随罗汉果的开发，其加工下脚料罗汉果籽却没能得到及时处理，对环境造成了污染[6-7]，极大地制约了罗汉果的深度开发。近几年也有少数学者开始研究罗汉果籽油的提取及性质。经研究发现其油中含有丰富的不饱和脂肪烃类化合物及大量的角鲨烯，角鲨烯可用于治疗肝病，具有一定的增强体质、抗疲劳、防癌、抗癌、保湿养颜的作用[8]。罗汉果籽的蛋白质含量高达13%左右，且其氨基酸组成合理、种类齐全，营养价值高，具有广阔的市场应用前景。但目前国内外鲜见关于罗汉果籽蛋白的提取研究[9]，鉴于此，作者拟采用碱溶酸沉法提取罗汉果籽中的蛋白质，通过单因素试验和响应面试验设计优化提取工艺，并系统评价罗汉果籽蛋白的功能特性，以期为罗汉果的深加工提供理论借鉴和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱脂罗汉果籽粉：桂林吉福思罗汉果有限公司；大豆分离蛋白：安阳漫天雪食品制造有限公司；色拉油：益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司；氢氧化钠、盐酸：生工生物工程有限公司；无水乙醇、冰醋酸、异丙醇：天津市德恩化学试剂有限公司；正己烷：天津市大茂化学试剂厂。试验所用试剂和化学品均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LYNX 4000型高速冷冻离心机、GenPure UF/UV型纯水超纯水系统：美国Thermo Scientific公司；FA124型电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；Alphal-2LD plus型真空冷冻干燥机：德国Christ公司；HJ-4型磁力搅拌器：金坛华峰仪器有限公司；SHA-CA型水浴恒温振荡器：北京市永光明医疗仪器有限公司；7200型可见光分光光度计：尤尼柯(上海)仪器有限公司；T18型数显型均质机：德国IKA 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 罗汉果籽蛋白的制备

脱脂罗汉果籽粉按比例与去离子水混合，调至一定pH值后，在指定温度下搅拌一段时间，4 ℃离心(8 000 r/min，15 min)，收集上清液，沉淀重复提取1次，合并2次上清液，调pH值至等电点，沉淀蛋白质，4 ℃离心(6 000 r/min，15 min)，收集沉淀蛋白，并用去离子水洗涤3次，调pH值至7.0，冷冻干燥回收成品，计算罗汉果籽蛋白提取率。

1.3.2 罗汉果籽蛋白溶解性测定

参考沈鑫婷等[10]的方法并稍有改动，考察罗汉果籽蛋白溶解性，以确定其等电点。取1.0 g罗汉果籽蛋白溶于蒸馏水，并定容至100 mL，室温下搅拌30 min，用1.0 mol/L NaOH调pH 9.0，室温搅拌提取30 min后，以8 000 r/min离心30 min，然后分别取等量上清液用1.0 mol/L NaOH或1.0 mol/L HCl溶液调pH值为2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，以8 000 r/min离心30 min后，测定上清液中残留蛋白质量，计算蛋白溶解性。

1.3.3 单因素试验

选取提取时间(0.5～2.5 h)、提取温度(25～45 ℃)、pH值(8.0～10.0)以及液固比(10～20 mL/g)等提取因素做单因素试验，考察蛋白提取率[11-12]。

1.3.4 响应面试验

在单因素试验基础上采用Design Expert试验设计软件中的响应面试验设计法[13]，以优化提取工艺条件。

1.3.5 罗汉果籽蛋白功能特性

以大豆分离蛋白(SPI)为对照，测定所得罗汉果籽蛋白(MSP)的乳化性、发泡性、持水性、持油性、凝胶性等功能特性。

1.3.5.1 乳化性

采用浊度法[14]，分别选用不同pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)的NaH2PO4-Na2HPO4(0.2 mol/L)缓冲液配制0.2%的蛋白溶液，将6 mL蛋白溶液与2 mL色拉油混合均匀，在均质机中均质1 min(8 000 r/min)，用微量取样器取50 μL，立即用0.1% SDS缓冲液稀释至5 mL，振荡3 s后迅速使用紫外分光光度计测定其在500 nm处吸光值A0，剩余样品静置10 min再次取50 μL重复操作，测定吸光值A1。

式中：D为稀释倍数，100；c为蛋白质的质量浓度，0.2 g/mL；φ为油相所占的分数，0.25。

1.3.5.2 发泡性

分别将1 g罗汉果籽蛋白溶于100 mL蒸馏水，调至不同pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)，此时蛋白溶液浓度为1%，以5 000 r/min均质2 min后迅速转移至250 mL量筒，蛋白溶液的泡沫所占体积V0，再将量筒转移至水浴锅中((30±1) ℃)静置30 min，此时泡沫残留体积Vr，计算蛋白发泡性和泡沫稳定性。

发泡性=V0/V×100%,泡沫稳定性=Vr/V0×100%,

式中：V为蛋白质溶液体积， 100 mL；V0为泡沫所占体积，mL；Vr为泡沫残留体积，mL。

1.3.5.3 持水性

参照高瑞平等[15]的方法，将0.2 g蛋白分散于20 mL蒸馏水中，分别调至不同pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)，使用移液管分别吸取不同pH值蛋白溶液5 mL，移入提前称质量的10 mL离心管，离心30 min(5 000 r/min)，弃上清液，再次称量离心管质量，计算样品持水能力(WHC)。

式中：m1为离心管质量，g；m2为弃去上清液离心管质量，g；m为5 mL蛋白溶液中蛋白质量，g。

1.3.5.4 持油性

称空离心管质量(m1)，加入0.5 g样品和5 mL色拉油，振动混合均匀，离心30 min(5 000 r/min)，弃去上层色拉油，称量离心管质量(m2)，计算样品的持油能力(OHC)。

1.3.5.5 凝胶性

分别配制不同浓度的蛋白溶液各10 mL，磁力搅拌1 h。反应结束后除去顶层泡沫，盖上锡箔纸封口，水浴加热至95 ℃，计时30 min，结束后取出冷却至室温，转移至4 ℃冰箱过夜储存，得成品凝胶，并得出蛋白质形成凝胶的最低浓度。质构仪测定条件：探头P6，测前、测中、测后速度均为1.0 mm/s，检测时间间隔3.0 s，数据采集速率200 pps，测定距离为凝胶厚度的30%，触发类型自动，触发力为1.0 g。

1.4 数据处理

试验数据均为3组平行处理的平均值，运用SPSS Statistics 21.0软件进行显著性分析，绘图软件使用Origin 8.0。

2 结果与分析

2.1 溶解性分析

溶解性是蛋白的重要性质，其对蛋白提取与分离有重要意义。pH值对罗汉果籽蛋白(MSP)和大豆分离蛋白(SPI)溶解性的影响如图1所示。在pH 2.0～10.0范围内，SPI和MSP的溶解度曲线相似均呈V型，pH<7.6时，SPI的溶解性高于MSP，pH>7.6之后，MSP的溶解性略高于SPI，在pH值达到4.5时，二者的溶解度均降到最低。故在后续蛋白质提取时，可将酸沉蛋白质的pH值定为4.5，以确保蛋白沉淀效果。

图1 不同pH值下SPI和MSP的溶解度

2.2 单因素试验结果

2.2.1 提取时间对罗汉果籽蛋白提取率的影响

固定提取温度35 ℃、液固比15、pH 9.0，考察提取时间对罗汉果籽蛋白提取率的影响，结果如图2所示。由图2可知，随着提取时间的延长，罗汉果籽蛋白的提取率逐渐增加，但提取时间到了1.5 h以后，增加幅度明显变缓。若提取时间过长，物料容易受微生物的污染，影响成品质量，且能耗较大[16]。因此，响应面试验中提取时间的变化范围定为1～2 h。

图2 提取时间对提取率的影响

2.2.2 提取温度对罗汉果籽蛋白提取率的影响

固定提取时间1.5 h、液固比15、pH 9.0，考察提取温度对罗汉果籽蛋白提取率的影响，结果如图3所示。由图3可知，随着提取温度的递增，罗汉果籽蛋白的提取率呈现先升高后降低的趋势。罗汉果籽蛋白的提取率出现下降趋势，可能是由于高温使罗汉果籽蛋白热变性失活沉淀，从而降低了提取率[17]。因此，响应面试验中提取温度的变化范围定为30～40 ℃。

图3 提取温度对提取率的影响

2.2.3 pH值对罗汉果籽蛋白提取率的影响

固定提取时间1.5 h、提取温度35 ℃、液固比15，考察pH值对罗汉果籽蛋白提取率的影响，结果如图4所示。由图4可知，随着pH值的上升，溶液的碱性增强，提取率也随之增大，但当pH值为9.0时，提取率的增长趋缓。pH值为10.0时，蛋白提取率最高，但其干燥后的成品颜色呈现深褐色，蛋白质量下降。这是由于pH值过高时，强碱性会使蛋白发生脱氨、脱羟和水解反应，影响成品的色泽及风味，甚至产生毒性化学物质，丧失食用价值[18-19]。因此，响应面试验中pH值的变化范围定为9.0～10.0。

图4 pH值对提取率的影响

2.2.4 液固比对罗汉果籽蛋白提取率的影响

固定提取时间1.5 h、提取温度35 ℃、pH 9.0，考察液固比对罗汉果籽蛋白提取率的影响，结果如图5所示。由图5可知，随着液固比增加，提取率也迅速上升，但当液固比为15.0时，提取率增长趋势开始变缓，当液固比17.5～20.0 mL/g时，蛋白质提取率仅增加1.73个百分点。在液固比较大时，提取液中的蛋白浓度过低，酸沉不易，从而影响蛋白得率[20]。因此，响应面试验中液固比的变化范围定为12.5～17.5 mL/g。

图5 液固比对提取率的影响

2.3 响应面试验结果

2.3.1 响应面设计方案及结果

根据单因素试验确定的变化范围，对提取时间(A)、提取温度(B)、pH值(C)及液固比(D)建立四因素三水平的响应面试验，因素与水平见表1，响应值设为罗汉果籽蛋白提取率(Y)，响应面设计方案与结果见表2。

表1 响应面因素与水平

表2 响应面设计及结果

利用Design-Expert7.0软件对试验结果进行多元二次回归拟合，得到二元多项回归方程：

Y=52.72+4.38A+1.08B+3.33C+5.60D+0.21AB+0.025AC+0.39AD-0.30BC+0.35BD+0.035CD-2.67A2-7.09B2+0.17C2-3.58D2。

由表3可知，影响蛋白质提取率的各因素主次顺序为液固比>提取时间>提取温度>pH值。

表3 模型方差分析

2.3.2 响应面分析

由模型得到三维响应面图如图6(a-f)所示，可直观地看出4个影响因素的交互作用对响应值的影响及变化趋势。图颜色变化得越快表示坡度越大，即对试验结果的影响更为显著[22]。

由图6a可以看出，提取温度与提取时间无交互作用，但三维曲面陡峭，线密度大，故A、B对响应值影响都显著，这与Kokabi等[23]的研究结果一致。图6b和图6f曲面与图6a相比较平缓，说明AC和CD对响应值的影响小于AB。而图6c、图6e等高线趋向于圆形，可见AD、BD交互作用均不显著，但图6d曲面呈弓形，说明B比C对因变量的影响更为显著。

图6 各因素交互作用对蛋白质提取率的影响

此试验在所选范围内回归模型存在最大值，最佳结果在试验考察的区域内，从而确定最适提取工艺：提取时间2 h，提取温度37 ℃，pH值10.0，液固比17.5，此时预测蛋白质提取率为63.38%。

2.3.3 最佳提取条件验证

为了验证模型的可靠性，采用最佳提取条件：提取时间2 h，提取温度37 ℃，pH值10.0，液固比17.5，对蛋白质提取工艺进行验证性试验，平行试验3次，蛋白质提取率平均值为63.33%，与理论预测值非常接近，证明该回归模型具有可靠性。

2.4 功能特性

2.4.1 乳化性分析

乳化性指蛋白质与水、油作用后，形成乳浊液的能力。蛋白质乳化性能越好，其与油脂的结合能力越好，通常更有利于在油脂类食品中的应用[24]。不同pH值下SPI和MSP的乳化活性指数(EAI)和乳化稳定性指数(ESI)如图7所示，当pH值从3.0升至4.0时，2种蛋白的乳化活性均迅速下降，在pH值为4.0～7.0之间MSP的乳化活性整体高于SPI，而从乳化稳定性来看，在pH 3.0～4.0时二者相差不大，但在pH值为4.0～7.0时MSP远高于SPI。综合来看，MSP乳化性优于SPI。

图7 不同pH值下SPI和MSP乳化活性及乳化稳定性

2.4.2 发泡性分析

优良的蛋白质发泡性会赋予食物良好的口感及松软的组织结构，通常有利于改善烘焙类食品加工特性[25]。图8为不同pH值下SPI和MSP 2种蛋白质的发泡性及泡沫稳定性对比。2种蛋白质的发泡性与pH值的关系趋势相似，但整体来看SPI的发泡性低于MSP。而对于泡沫稳定性，SPI的整体表现高于MSP，但在pH为3.0、5.0、6.0时，二者相差不大，故应用MSP发泡功能时要综合考虑pH值。

图8 不同pH值下SPI和MSP发泡性及泡沫稳定性

2.4.3 持水性分析

SPI和MSP在不同pH值下的持水性如图9所示，由图9可知，2种蛋白的持水性呈现U型趋势，均在pH 5.0时持水性最低，在酸性和偏碱性的环境中达到较高的数值。这是由于pH值对蛋白质带电性有影响。在等电点处，蛋白质以分子形式存在，彼此之间的相互作用力最强，而与水之间的相互作用力最弱；反之，在远离等电点处时，蛋白质的持水力最高。由图9可知，SPI在所有pH值下的持水力都高于MSP。

图9 不同pH值下SPI和MSP持水性

2.4.4 持油性分析

持油性是指对油吸附并将油截留在组织内部的能力。由图10可知，在试验10 min时，SPI和MSP的持油能力分别为424 g/100 g和261 g/100 g，可知MSP的持油能力差于SPI。随着静置时间的延长，2种蛋白的持油性改变不大。可能是由于2种蛋白结合的油脂能够在短时间达到饱和。

图10 不同时间下SPI和MSP持油性

2.4.5 凝胶性分析

蛋白质凝胶的形成可以定义为蛋白质分子的聚集现象，在这种聚集过程中，吸引力和排斥力处于平衡状态，以至于形成能保持大量水分的高度有序的三维网络结构或基体[26]。而凝胶特性是蛋白质在应用中的重要功能特性，蛋白质的凝胶行为以及流变性是形成某些食品独特的质构、感官和风味的决定性因素。

表4为在中性条件下，蛋白含量对凝胶形成的影响。由表4可知，MSP、SPI最小成胶添加量分别为14%、12%，二者在添加量上对成胶性的影响差别不大。

根据表4的结果，选取添加量18%的MSP和SPI凝胶进行质构特性检测，结果如表5所示。

表4 不同MSP和SPI添加量对成胶性的影响

由表5可以看出，MSP和SPI凝胶的硬度、弹性、内聚性接近。MSP黏性优于SPI，而其胶黏性、咀嚼性和回弹性低于SPI，这表明MSP可用作食品增稠剂。

表5 MSP和SPI凝胶质构特性

3 结论

以脱脂罗汉果籽粉为原材料，采用碱溶酸沉法提取罗汉果籽蛋白，通过单因素试验和响应面试验设计，考察了提取时间、提取温度、pH值、液固比对蛋白提取率的影响，并确定其最适提取工艺：提取时间2 h，提取温度37 ℃，pH值10.0，液固比17.5 (mL/g)，在此条件下蛋白质提取率为63.33%，与理论预测值接近。所得罗汉果籽蛋白的乳化性和发泡性优于大豆分离蛋白，而其溶解性和持水性稍逊，二者的凝胶特性接近。本研究的结果表明罗汉果籽蛋白是一种优质的植物蛋白，可用于食品工业。