QuEChERS前处理结合HPLC-MS/MS同时测定原料乳中30种兽药残留

李婧妍，韩波，安乐，张瑞雪

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，农业农村部食品质量监督检验测试中心（杨凌），陕西 杨凌 712100）

原料乳通常是从奶牛乳房挤出来未经过处理的生牛乳，优质、安全的原料乳供应是现代乳业健康发展的重要保障。为促进奶牛生长、防止各类疾病、降低死亡率，兽药被广泛应用于奶牛养殖[1-2]。但由于兽药使用过程中滥用、误用以及不遵守休药期等现象屡禁不止，导致过量的兽药在牛奶中蓄积与残留，当残留量超过一定限度时，会对人体造成潜在的危害[3-5]。GB 31650—2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》里明确规定了不得检出的兽药清单和禁用且不得检出的兽药清单，其中β-激动剂类、磺胺类和喹诺酮类兽药是我国畜禽产品重点监控项目，也是我国农业部门和市场监管部门执行畜禽产品质量安全例行监测项目中主要监测指标。

高效液相色谱-串联质谱技术（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）广泛应用于兽药残留的检测，该方法通过保留时间、特征离子以及离子对丰度比进行定性、定量分析，方法专属性强、灵敏度高。兽药残留检测中应用较多的前处理技术有液液萃取[6]、固相萃取[7]、加速溶剂萃取[8]、盐析液相萃取法[9]、分散固相萃取[10]等。这些方法前处理过程复杂，大多需经过提取、净化、浓缩等步骤，且消耗耗材多、试验周期长、方法灵敏度低。快速、简便、低价、有效、稳定、安全（quick、easy、cheap、effective、rugged、safe，QuEChERS）提取法具有高通量、试剂消耗少、成本低、环境友好的优势，可同时检测多种类药物，被广泛应用于农产品和畜禽产品中多药物残留检测。在乳制品兽药残留检测中，QuEChERS提取法已应用于大环内酯类、喹诺酮类、磺胺类、胺酰醇类等兽药的检测[11-12]，但检测对象多为单一类兽药，且没有同时检测β-激动剂类、磺胺类和喹诺酮类兽药的研究方法。

QuEChERS提取法用于原料乳中多种类兽药残留的检测存在两个关键问题：原料乳基质成分复杂，乳蛋白、乳脂肪、乳糖以及维生素和矿物元素等因素对兽药残留定量产生干扰[13]；另外，原料乳中同时存在脂溶性和非极性兽药，而非极性兽药又易与乳脂肪结合，导致兽药提取难度增大，因此建立适宜的样品提取方法对定量检测至关重要。本文以原料乳为研究对象，通过考察提取溶剂、提取方法、净化剂组成及配比对目标兽药回收率的影响，建立QuEChERS提取法结合HPLC-MS/MS同时测定原料乳中β-激动剂类、磺胺类和喹诺酮类兽药的分析方法，可在1个试验周期内同时检测样品中30种兽药残留，降低了检测成本，缩短了检测时间，对原料乳的质量安全控制具有较高的实用价值。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

LC-2010A高效液相色谱：日本岛津公司；AB 4000 Q-Trap串联质谱仪：美国SCIEX公司；电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）、MS3 型涡旋振荡器：德国IKA公司；Allegra 64R高速冷冻离心机：美国Beckman公司；xs105DU十万分之一分析天平：瑞士Mettler Toledo公司；DCY-III氮吹水浴浓缩仪：北京金科精华苑技术研究所；Milli-Q超纯水仪：美国Millipore公司。

1.2 材料与试剂

克伦特罗（clenbuterol，CLE）、沙丁胺醇（salbutamol，SAL）、莱克多巴胺（ractopamine，RAC）、特布他林（terbutaline，TER）、西马特罗（cimaterol，CIM）、非诺特罗（fenoterol，FEN）、氯丙那林（clorprenaline，CLO）、妥布特罗（tulobuterol，TUL）、喷布特罗（penbuterol，PEN）标准品（纯度均≥99%）：美国Sigma-Aldrich公司；丹诺沙星（danofloxacin，DAN）、恩诺沙星（enrofloxacin，ENR）、沙拉沙星（sarafloxacin，SAR）、环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、氧氟沙星（ofloxacin，OFL）、诺氟沙星（norfloxacin，NOR）、依诺沙星（enoxacin，ENO）、培氟沙星（pefloxacin，PEF）、双氟沙星（difloxacin，DIF）、磺胺醋酰（sulfacetamide，SAA）、磺胺嘧啶（sulfadiazine，SD）、磺胺噻唑（sulfathiazole，STZ）、磺胺吡啶（sulfapyridine，SP）、磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine，SM）、磺胺二甲嘧啶（sulfamethazine，SMZ）、磺胺甲噻二唑（sulfamethizole，SMT）、磺胺对甲氧嘧啶（sulfameter，SME）、磺胺氯哒嗪（sulfachloropyrida，SCP）、磺胺邻二甲氧嘧啶（sulfadoxine，SDO）、磺胺甲恶唑（sulfamethoxazole，SMX）、磺胺二甲基异噁唑（sulfisoxazole，SIX）标准品（纯度均≥99%）：德国Dr Ehrenstorfer公司；十八烷基硅烷（n-octadecylsilane，C18）、N-丙基乙二胺 （primary-secondary amine，PSA）、氨基（amino，NH2）净化剂：天津博纳艾杰尔公司；乙腈（acetonitrile，ACN）、甲醇（均为色谱纯）：美国天地有限公司；甲酸、MgSO4、Na2SO4、NaCl、Na2HPO4、柠檬酸、EDTA-2Na·2H2O（均为分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；试验所用原料乳购自于陕西西安、咸阳和宝鸡等地区奶牛养殖场。pH4.0的乙二胺四乙酸-Mcllvaine（ethylene diamine tetraacetic acid-Mcllvaine，EDTA-Mcllvaine）0.1 mol/L缓冲液通过以下方法制备：准确称取10.9 g Na2HPO4、37.2 g EDTA二钠盐和12.9 g一水柠檬酸用超水溶解，定容至1.0 L。

1.3 色谱和质谱分析条件

LC-2010A高效液相色谱仪配备Shim-pack XRODS（I.D.3.0 mm × 75 mm，2.2 μm）色谱柱；流动相 A：0.1%甲酸溶液，B：乙腈。流速：0.3 mL/min；进样量：10 μL。AB 4000 Q-Trap串联质谱仪，配备ESI多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）正离子扫描模式，离子源温度：550℃；电喷雾电压：5 000 V；气帘气电压：69 kPa；喷雾气压力：345 kPa；辅助气压力：345 kPa条件下，依次进行一级和二级质谱扫描，确定母离子、定量子离子和定性子离子，在多反应监测模式下对质谱参数，如去簇电压（declustering potential，DP）和碰撞电压（collision energy，CE）等进行优化。

1.4 标准溶液配制

准确称取所有标准品各100 mg（精确至0.01 mg），置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶液稀释至刻度，即为浓度1.0 mg/mL的标准储备液，-20℃避光储存3个月。吸取1mL上述溶液至100 mL容量瓶中，用甲醇溶液稀释至刻度，配制为浓度10 μg/mL的中间工作液（5℃避光储存2周）。吸取上述溶液10 mL加入到100 mL容量瓶中，用乙腈溶液稀释至刻度，即为30种兽药浓度均为1.0 μg/mL的混合标准溶液（保质期为1周）。

1.5 原料乳的前处理方法

准确称取10 g原料乳（精确到0.01g）置于50 mL具塞离心管中，加入8 mL乙腈、2 mL 0.1 mol/L EDTAMcllvaine和0.1 mL乙酸，涡旋振荡2 min，样品和溶剂完全混合后，加入2 g NaCl和2 g Na2SO4继续涡旋振荡1 min，以10 000 r/min离心5 min，取4 mL上层乙腈相，加入100 mg C18和100 mg PSA净化剂，涡旋振荡1 min，50℃水浴氮气吹干后，残渣用1.0mL10%水乙腈溶液复溶，溶液过0.22 μm有机滤膜至进样瓶中，供HPLC-MS/MS分析。

1.6 基质效应和基质标准曲线制备

基质效应（matrix effect，ME）用加标量为 10 μg/kg的空白样品峰面积（Am）和溶剂标峰面积（Ai）计算，重复3次，计算公式如下。

以空白样品提取液作为标准溶液的稀释液，配制浓度分别为0.5 μg/kg～100.0 μg/kg的基质标准曲线。以各组分浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制基质标准曲线。

1.7 方法回收率及检出限和定量限测定

称取待测样品10 g，加入适量的混合标准溶液，配制成30种兽药加标量分别为5.0、10.0、20.0 μg/kg 3个浓度的加标样品，每个浓度平行测定3份样品，计算批内和批间回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）分别通过加标样品（10 μg/kg）3倍和10倍信噪比计算。

1.8 数据处理

色谱数据分析采用AB 4000 Q-Trap Analyst软件进行处理，回收率和精密度试验数据由Office Excel软件处理，统计图采用Origin Pro 8.5制作。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

30种目标兽药经质谱优化得到的最佳参数见表1。

表1 30种兽药的多反应监测参数Table 1 MRM parameters for the 30 veterinary drugs

2.2 色谱条件的优化

30种兽药经液相色谱条件优化得到的总离子流图见图1。

图1 原料乳中30种兽药的总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms of the 30 veterinary drugs in raw milk

由图1可知，以乙腈为有机相时，目标物离子化效率和灵敏度高，峰行对称且较窄、分离效果普遍较好。采用甲醇为有机相时，色谱峰形不对称，出现拖尾。当水相中不添加甲酸时，喹诺酮类兽药存在拖尾现象。添加0.1%甲酸后，峰形得到明显改善。这是因为喹诺酮类兽药极性较大，且该类化合物中含有羧酸和哌嗪基，属于酸碱两性化合物，色谱峰容易拖尾，而以酸性溶液作为流动相可改善拖尾现象。对色谱梯度洗脱程序进行优化，反复试验后确定为0～7.0 min，90%A～60%A；7.0 min～20.0 min，10%A ；20.0 min～20.1 min，10%A～90%A，保持到 34.0 min。

2.3 提取条件优化

在QuEChERS前处理方法中，乙腈是提取兽药残留常用试剂，具有良好的蛋白沉淀作用。考虑到喹诺酮类（羧基和氨基）兽药为两性物质，酸性环境离子化程度高[14]，并且磺胺类兽药在酸化乙腈中具有较好的溶解性[15-16]，因此本研究以1.0%乙酸乙腈为提取剂，考察不同体积比（9∶1、8∶2、7∶3）乙酸乙腈与 EDTA-Mcllvaine缓冲液对30种兽药提取效果的影响，结果见图2。

图2 提取液比例对30种兽药回收率的影响Fig.2 Effect of extracting solutions rate on recoveries of the 30 veterinary drugs

由图2可知，当乙酸乙腈和EDTA-Mcllvaine缓冲液体积比为8∶2时，目标兽药的提取效率最高，兽药回收率均在70.6%～96.3%之间。不同体积比（9∶1、8 ∶2、7∶3）乙酸乙腈和 EDTA-Mcllvaine缓冲液对喹诺酮类兽药影响较大，当提取液中EDTA-Mcllvaine缓冲液含量较低时，原料乳中存在钙、镁等矿物元素，会与喹诺酮类化合物发生一定的螯合反应，导致回收率降低。加入体积比为8∶2的乙酸乙腈和EDTAMcllvaine缓冲液可络合乳中的钙镁离子，使喹诺酮保持溶解状态，从而提高提取率[17]。

2.4 盐析剂和脱水剂条件优化

NaCl、Na2SO4、MgSO4是 QuEChERS 方法中常用的盐析剂和脱水剂[11，18]，试验分别对比了NaCl和 Na2SO4、NaCl和MgSO4对各类兽药回收率的影响。当选用NaCl和MgSO4作为盐析剂时，喹诺酮类和磺胺类兽药的回收率有不同程度降低，最高降低幅度达到30%。这是因为喹诺酮类兽药易与Mg2+形成螯合物导致溶解度降低。当选用NaCl和MgSO4时，回收率明显提高，因此本试验选用NaCl作为盐析剂、Na2SO4作为脱水剂。

2.5 净化剂条件优化

液态乳基质中存在脂肪、蛋白、乳糖、维生素和矿物质等杂质，因此净化剂的选择既要能有效除去乳中杂质，又不会吸附目标物。试验比较了不同含量（50、100、200 mg）C18、PSA和NH23种净化剂的净化效果，结果分别见图3。

图3 C18、NH2和PSA净化剂对30种兽药回收率的影响Fig.3 Influence of C18，NH2and PSA sorbents on the recovery of the 30 veterinary

由图3可知，使用NH2为净化剂时，喹诺酮和磺胺类兽药回收率为30%～60%，说明该净化剂对目标物产生了吸附作用。PSA具有良好的吸附糖类、脂肪酸和其他极性有机酸作用[19]，当使用100 mg PSA作为净化剂时，除了 TUL（49.6%）、SD（45.2%）、SP（46.5%）、SDO（45.4%），其他兽药的回收率为50.8%～89.7%。C18主要吸附非极性物质[20]，净化乳脂肪效果较好，但C18净化剂用量为100 mg时，β-激动剂类兽药的回收率低于70%。考虑到两种净化剂在净化效果方面的互补性，试验进一步考察C18和PSA两种净化剂组合使用对兽药回收率的影响，当C18和PSA用量为100 mg时，兽药回收率可达到70%以上，随着PSA和C18用量的增加，回收率降低。综合考虑净化效果和方法回收率，最终确定100 mg C18和100 mg PSA作为混合净化吸附剂。

2.6 基质效应评价

在最佳净化条件下，对30种目标物的基质效应进行了评价，结果如图4所示。

图4 基质效应Fig.4 Matrix effect

由图4可知，12种目标物显示了基质抑制效应，ME为65.4%～99.0%，其中SAR（65.0%）、PEF（69.7%）、RAC（65.4%）和SDO（67.9%）存在明显的抑制效应。其他18种目标物ME为100%～160%，其中FEN（140.2%）和SAA（130.3%）存在明显的基质增强效应。基质效应是由样品基质中的共体干扰物与目标化合物竞争电离所致，导致目标成分在离子化时受到样品基质中某些成分的影响而引起分析信号改变，与目标物浓度、提取方法以及离子化程度关，且基质效应的变化有不确定因素[13]。为使定量分析结果准确可靠，本试验采用基质匹配标准溶液作为校准曲线以降低基质效应对结果准确性的影响。

2.7 方法有效性

方法有效性依据欧盟规定2002/657/EC对线性回归、回收率、重复性（批内精密度）和再现性（批间精密度）、LOD和LOQ进行评价，结果见表2。

表2 30种兽药的线性方程、线性范围、相关系数（r）、回收率、检出限、定量限、批内和批间精密度Table 2 Linear range，linear equations，correlation coefficient（r），recovery，LOD，LOQ ，intra-precision and inter-precision of 30 veterinary drugs

由表 2 可知，30 种化合物在 0.5 μg/kg～100.0 μg/kg的质量浓度范围内线性关系良好，线性相关系数（r）均大于 0.99。目标化合物的检出限为 0.10 μg/kg～1.21 μg/kg，定量限为 0.40 μg/kg～4.05 μg/kg，这个结果与国家标准方法和其他研究相比相近似或更低[21-22]。试验选择阴性样品添加3个浓度水平（5.0、10.0、20.0 μg/kg）混合物标准溶液，每个浓度加标水平做6个平行样，考察方法回收率和精密度。30种目标化合物的回收率为71.1%～94.8%，RSD低于12.2%。

2.8 实际样品分析

采用本方法对陕西西安、咸阳和宝鸡地区农户的50份原料乳样本进行了测定，所测原料乳中发现一个样品中氧氟沙星含量为3.5 μg/kg，另一个样品中恩诺沙星含量为 2.47 μg/kg。

3 结论

本文采用QuEChERS前处理结合HPLC-MS/MS技术，通过优化色谱质谱条件、提取条件和净化条件，建立了快速测定原料乳中30种兽药残留的分析方法。与传统兽药提取前处理方法相比，本方法具有前处理简单快捷、有机溶剂用量少、灵敏度高等优点，且该方法成功用于实际样品的测定，可作为原料乳中兽药的定性定量检测手段，对原料乳中兽药残留情况的监测具有重要的用应用价值。