超声波细胞破碎法辅助提取山黄皮果熊果酸的工艺优化

王冬梅，黄振勇，梁晓君，韦馨平，任惠，淡明，徐兵强，张娥珍*

（1.南宁市农业科学研究所，广西 南宁 530021；2.广西农业科学院农产品加工研究所，广西 南宁 530007；3.广西农业科学院园艺研究所，广西 南宁 530007；4.中国热带农业科学院海口实验站，海南 海口 570000）

山黄皮果（Clausena excavata），俗称鸡皮果，因其果实熟透后果皮色泽和经络像煮熟的鸡皮而得名，属芸香科黄皮属多年生树种，主要分布于我国广西、云南、广东等地，越南、菲律宾等国家也有少量分布[1]。山黄皮果实中含有丰富的维生素C[2]、氨基酸[3-4]、黄酮[5]和多种萜烯类化合物[6]，营养价值极高，属食药两用植物，果实可新鲜食用、干燥入药或用作调味品等，具有消脂健胃、清热解毒等功效。熊果酸（ursolic acid，UA）又名乌索酸，是一种五环三萜类天然化合物，普遍存在各种水果和植物中，熊果酸不溶于水，易溶于醇类，具有良好的抗氧化性。熊果酸在抑制肿瘤[7]、降血糖[8]、降血脂[9]、护肝[10]、减肥[11]以及治疗代谢综合症[12]等方面具有显著效果，在功能产品开发上具有较高的开发潜力。市面上山黄皮果的产品常见的为其干制品、盐渍品和酱制品[13]，近年来对山黄皮果的研究也多集中在种质资源收集和品种选育方面[14-16]，山黄皮果实黄酮[17]、挥发油[18]等，但加工方面的研究比较少，尤其对其果实熊果酸方面的研究报道较少。目前熊果酸的提取主要有回流法[19]、超临界萃取[20]、亚临界提取[21]、微波辅助提取[22]和超声波辅助提取[23]等方法，其中比较常用的是超声波辅助提取法，操作简单，提取效果好。山黄皮果具有非常好的开发应用前景，但是目前山黄皮果深加工方面的开发力度有限，产品附加值不高，产业发展缓慢。本研究采用超声波细胞破碎法对山黄皮果实中熊果酸进行提取，通过单因素和响应面法相结合优化熊果酸提取工艺，为特色功能食品开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与设备

山黄皮果（桂研15号）：采自广西龙州县。

熊果酸标准品：上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇、香兰素、冰乙酸、乙酸乙酯（均为分析纯）：成都市科隆化学品有限公司。

超声波细胞破碎仪（JY98-Ⅲ DN）：宁波新芝生物科技股份有限公司；高速冷冻离心机（3-18KS）：西格玛实验室离心机公司；真空冷冻干燥机（LGJ-100F型）：北京松源华兴科技发展有限公司；高速万能粉碎机（FW80）：天津市泰斯特仪器有限公司；紫外可见分光光度计（UV-6100）：上海元析仪器有限公司；电子分析天平（ATX-124）：日本岛津公司。

1.2 方法

1.2.1 山黄皮果的预处理

新鲜采摘回来的山黄皮果用流动水清洗，沥干水分，去除果蒂，对半横切，平铺于冻干盘中，放置至真空冷冻干燥机，设置冷阱温度-65℃，样品温度35℃，真空度≤60 Pa，进行自动冻干[24]。冻干后的山黄皮果取出后用高速万能粉碎机迅速打粉，装入塑料袋封口密封，-20℃冰箱贮藏备用。

1.2.2 熊果酸标准曲线的绘制

熊果酸的测定采用分光光度法[25]。分别准确移取0.4 mg/mL 熊果酸标准溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.7 mL于10 mL比色管，加热挥干去除溶剂，冷却后依次加入0.8mL5%香兰素冰乙酸溶液和2mL高氯酸，混合均匀，60℃水浴30 min，流动水冷却至25℃，用乙酸乙酯定容至10 mL，混匀，以不添加熊果酸标准液管作为空白对照，于546nm波长处测量吸光值，建立标准曲线。得回归曲线方程：y=0.034 6x-0.026 7，R2=0.999 1。

1.2.3 山黄皮果熊果酸提取工艺

熊果酸提取工艺参考陈静等[26]方法并作修改。山黄皮果粉按料液比1∶30（g/mL）加入蒸馏水，加热煮沸10 min，抽滤，收集滤渣进行真空冷冻干燥。称取一定量干燥后的山黄皮果渣粉，按一定料液比加入乙醇溶液，超声波细胞破碎提取一定时间，离心取上清液即为待测液，按标准曲线方法测定待测液熊果酸含量。熊果酸提取量计算公式如下。

式中：X为提取液中熊果酸含量，mg/mL；V为提取液总体积，mL；m为样品质量，g。

1.2.4 单因素试验

根据单因素变量原则，分别考察料液比为1∶10、1 ∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL），乙醇浓度为40%、50%、60%、70%、80%、90%，超声功率为 150、200、250、300、350 W 和超声时间为 20、30、40、50、60 min 对山黄皮果熊果酸提取效果的影响。

1.2.5 响应曲面试验设计

在单因素试验基础上，选择料液比、乙醇浓度、超声功率、超声时间4个因素为影响因素，以熊果酸提取量为响应值，利用Design-Expert 10软件，根据Box-Benhnken试验原理设计响应面优化试验，试验因素水平见表1。

表1 响应面设计方案因素水平Table 1 Response surface design factor level

1.3 数据处理及统计

采用Excel软件对试验数据进行整理，用Design-Expert 10软件进行响应面设计和分析，用Origin pro 2017进行显著性分析并绘图，P<0.05表示有显著差异，P<0.01表示有极显著差异。

2 结果与分析

2.1 料液比对熊果酸提取效果的影响

料液比对山黄皮果熊果酸提取的影响见图1。

图1 料液比对熊果酸提取效果的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on ursolic acid extraction

由图1可知，一定范围内，提高溶剂用量能显著提高山黄皮果熊果酸的提取量（P<0.05），当料液比为1 ∶25（g/mL）时，熊果酸含量最高达到了 4.67 mg/g；随着溶剂用量继续升高，熊果酸提取量逐步下降，但变化不大（P>0.05）。产生此结果的原因可能是适当提高溶剂用量有助于超声波空化作用的形成，促进熊果酸的溶出，但是溶剂用量过高对空化作用有所削弱，导致熊果酸提取量下降[27]。综合考虑，料液比选择在1 ∶20（g/mL）～1 ∶30（g/mL）较为适宜。

2.2 乙醇浓度对熊果酸提取效果的影响

乙醇浓度对山黄皮果熊果酸提取的影响见图2。

图2 乙醇浓度对熊果酸提取效果的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on ursolic acid extraction

由图2可知，当乙醇浓度从40%提高到50%时，熊果酸提取量从3.16 mg/g提高到了4.58 mg/g，提高了44.81%，提高效果显著（P<0.05）；在乙醇浓度为60%时，熊果酸提取量达到了5.02 mg/g，显著高于其他处理（P<0.05）；当继续提高乙醇浓度，熊果酸提取量有明显下降趋势（P<0.05）。熊果酸易溶于有机溶剂，一定范围内提高乙醇浓度，使乙醇浓度的极性与熊果酸相近，有利于熊果酸的溶出，但是继续提高乙醇浓度，其溶液极性与熊果极性差距加大，会导致提取量下降[25]。综合考虑，山黄皮果熊果酸提取在乙醇浓度50%～70%较为适宜。

2.3 超声功率对熊果酸提取效果的影响

超声功率对山黄皮果熊果酸提取效果的影响见图3。

图3 超声功率对熊果酸提取效果的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on ursolic acid extraction

由图3可知，超声功率从150 W增加到200 W时，山黄皮果熊果酸提取量从4.23mg/g提高到4.96mg/g，提高了17.06%，效果显著（P<0.05）；在超声功率为250 W时，熊果酸提取量最高达到5.06 mg/g，随着超声功率增加，熊果酸提取量变化不明显（P>0.05），在超声功率增加到350 W时，熊果酸含量有显著下降（P<0.05）。从能耗方面考虑，山黄皮果熊果酸提取超声功率范围选择在200 W～300 W之间较为适宜。

2.4 超声时间对熊果酸提取效果的影响

超声时间对山黄皮果熊果酸提取效果的影响见图4。

图4 超声时间对熊果酸提取效果的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on ursolic acid extraction

由图4可知，20 min～40 min时，熊果酸提取量差异不显著（P>0.05）；在超声时间为50 min时，熊果酸提取量达4.75 mg/g，高于其他处理。随着超声时间的延长，熊果酸提取量有所降低，在超声时间为70 min时，熊果酸提取量显著低于其他处理（P<0.05），其中原因可能是超声时间过长，在超声波的热效应和机械效应作用下，熊果酸发生分解[28]，从而导致含量降低。因此，超声时间在40 min～60 min较为适宜。

2.5 响应面优化山黄皮果熊果酸提取工艺

2.5.1 回归模型建立和方差分析

根据单因素试验结果，以熊果酸提取量为响应值，以料液比、乙醇浓度、超声功率、超声时间为影响因素，用Design-Expert 10软件进行响应面试验设计，响应面试验结果及方差分析分别见表2和表3。

表2 响应面优化结果Table 2 Results of response surface optimization

表3 方差分析结果Table 3 Results of variance analysis

对表2数据进行回归分析，得回归方程：Y=5.02+0.28A+0.15B-0.013C+0.19D+0.076AB-0.38AC-0.064AD+0.10BC+0.20BD-0.1CD-0.52A2-0.5B2-0.36C2-0.11D2。

由表3可知，模型P<0.01，说明模型极显著，失拟项P>0.05，表现为不显著。决定系数R2=0.997 1，调整后系数R2Adj=0.994 1，说明模型拟合效果较好。各因素对山黄皮果熊果酸提取影响的顺序：料液比>超声时间>乙醇浓度>超声功率。除一次项C对山黄皮果熊果酸提取影响不显著外，其他项影响均极显著（P<0.01）。

2.5.2 交互作用分析

各因素对山黄皮果熊果酸提取影响的响应面和等高线见图5～图10。

图8 乙醇浓度与超声功率响应面及等高线Fig.8 Response surface and contour of ethanol concentration and ultrasonic power

图9 乙醇浓度与超声时间响应面及等高线Fig.9 Response surface and contour of ethanol concentration and ultrasonic time

图10 超声功率与超声时间响应面及等高线Fig.10 Esponse surface and contour of ultrasonic power and ultrasonic time

响应面中，曲线越弯曲、边线越陡则该因素对多糖提取率的影响越大，等高线呈椭圆说明因素间交互影响显著[29-30]。从图5～图10响应面曲面可知，各交互项曲面均较为陡峭，随着各因素的增加，响应值均呈先增加后减少的趋势，等高线接近椭圆，说明各交互项对响应值的影响都极显著（P<0.01），结果与方差分析一致。

2.5.3 最佳工艺验证试验

根据响应面优化结果得到的最佳工艺参数：料液比1∶26.6（g/mL）、乙醇浓度 59.51%、超声功率 233.69 W、超声时间59.75 min，在此工艺上，山黄皮果熊果酸提取量理论值为5.16 mg/g。考虑实际可操作性，调整工艺参数为料液比1∶27（g/mL）、乙醇浓度60%、超声功率234 W、超声时间60 min。对所得最佳工艺参数进行验证，做3个平行试验取平均值，结果得到山黄皮果熊果酸的提取量为5.15 mg/g，接近预测值。由此表明，预测值与实际值有良好的拟合性，响应面优化结果可靠，该工艺可有效提高山黄皮果熊果酸提取量。

3 结论

熊果酸是一种天然三萜类化合物，具有抗致癌、抗促癌、降血糖等多种生物学活性，有较高的开发利用价值。本试验在单因素基础上，以熊果酸提取量为响应值，通过响应面法优化了超声波细胞破碎法辅助提取山黄皮果熊果酸的工艺条件，确定了各因素对山黄皮果熊果酸提取量的影响顺序为料液比>超声时间>乙醇浓度>超声功率。优化后山黄皮果熊果酸的最佳工艺条件为料液比1∶27（g/mL）、乙醇浓度60%、超声功率234 W、超声时间60 min，根据此工艺山黄皮果熊果酸的提取量达5.15 mg/g。