皮肤恶性黑色素瘤组织中微小RNA-185-5p、SOX13的表达及临床意义

陈 华, 严 旭, 宋树玲

(1. 山东省枣庄市皮肤病性病防治院 皮肤科, 山东 滕州, 277500;2. 山东省滕州市中心人民医院 皮肤科, 山东 滕州, 277500;3. 山东省枣庄市立医院 皮肤科, 山东 枣庄, 277000)

皮肤恶性黑色素瘤(CMM)为皮肤科常见恶性肿瘤，其起病隐匿，易发生转移，病死率高，预后较差[1], CMM的发病率占皮肤恶性肿瘤的5%左右，在皮肤恶性肿瘤中病死率最高[2], 临床常用手术、放化疗等方式治疗，但很难彻底治愈，目前关于CMM的发病机制尚不十分清楚，因此，研究CMM的发病机制对CMM的治疗具有重要意义。微小RNA(miRNA)为非编码小分子RNA, 参与调控细胞增殖、分化，并与多种疾病如恶性肿瘤的发生和发展有关[3]。miR-185-5p为常见的一种微小RNA, 在多种肿瘤中表达下调，上调肿瘤细胞中miR-185-5p表达可显著抑制肿瘤的增殖[4]。研究[5]显示，过表达miR-185-5p可靶向调控MAPK14, 阻断细胞上皮间质转化，抑制黑色素瘤A375细胞的侵袭、迁移和肿瘤形成。SOX13属于SOX基因家族中的一种转录因子，在恶性肿瘤的发生中发挥重要作用。研究[6]表明，结直肠癌组织中SOX13的表达明显上调，因此阻断SOX13表达可抑制结直肠癌的迁移、侵袭与转移。本研究检测CMM组织中miR-185-5p与SOX13的表达情况，初步探讨miR-185-5p、SOX13与CMM发生、发展的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2015年6月—2018年4月行手术治疗的61例CMM患者为观察对象，取所选患者的CMM组织标本(CMM组)。61例CMM患者中，男38例，女23例; 年龄31～80岁，平均(59.70±11.40)岁; 肿瘤直径<2 cm者27例, ≥2 cm者34例; 发病部位为头颈部26例，躯干部12例，四肢23例; 肿瘤分期Ⅰ～Ⅱ期者29例, Ⅲ～Ⅳ期者32例; 淋巴结转移者33例，无淋巴结转移者28例。纳入标准: ① 经病理学检查确诊为CMM者; ② 术前未经药物、激光、放射治疗者; ③ 患者临床资料完整。排除标准: ① 合并糖尿病、高血压等严重慢性疾病者; ② 合并其他恶性肿瘤者。另外，选取同时期61例诊断为皮肤良性色素痣的健康人群的组织标本为对照组，其中男40例，女21例，年龄32～78岁，平均(59.50±11.50)岁，发病部位为四肢者29例，非肢端32例。研究样本采集均经过伦理委员会批准。CMM组与对照组标本供者的性别、年龄、发病部位等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 主要试剂

miR-185-5p、SOX13及内参基因GAPDH、U6的引物由广州锐博生物技术公司设计与合成, miRNeasy Mini Kit购自Qiagen公司, TaqmanmicroRNA reverse Transcription Kit购自Thermo Fisher公司, SYBR Green qPCR Mix、免疫组化试剂盒、DAB试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，兔抗人SOX13多克隆抗体购自Elabscience公司。

1.3 方法

1.3.1 实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测CMM组织与色素痣组织中SOX13、miR-185-5p的表达: 手术取患者CMM组织及色素痣组织标本, -80 ℃冰箱冻存。取冷冻标本，采用qRT-PCR检测miR-185-5p、SOX13mRNA的表达，引物序列见表1。反应结束后，分别以U6、GAPDH为内参基因，采用2-△△CT分析法计算miR-185-5p、SOX13mRNA的相对表达量，每个样品设置3个复孔，取平均值。

表1 qRT-PCR检测的引物序列

1.3.2 免疫组织化学染色: 将手术过程中取得的标本进行石蜡包埋，连续切片后，经过脱蜡、抗原修复和封闭，之后加入兔抗人SOX13多克隆抗体(按照1∶500稀释), 4 ℃冰箱孵育过夜后，加入二抗(按照1∶1 000稀释)，室温孵育1 h, DAB染色，苏木素复染，采用显微镜观察。染色结果判断: SOX13阳性表现为黄色颗粒，主要定位于细胞核，根据阳性细胞占比进行评分, 0～10%、>10%～25%、>25%～50%、>50%～75%、>75%分别判为0、1、2、3、4分。根据细胞着色深度进行评分，无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将2项评分相乘，总分≤1分判为阴性(-)，总分≥2分为阳性(+)。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0进行统计学分析, miR-185-5p、SOX13mRNA表达水平用均数±标准差表示，组间比较采用t检验; 计数资料采用[n(%)]表示，组间比较采用卡方检验; Pearson法分析CMM组织中miR-185-5p与SOX13mRNA表达水平的相关性; Kaplan-Meier生存曲线分析miR-185-5p、SOX13表达与CMM患者生存率的关系; Cox回归模型分析CMM患者的预后影响因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CMM组织与色素痣组织中miR-185-5p及SOX13 mRNA表达水平比较

CMM组织中, miR-185-5p表达水平为(0.47±0.08), 低于色素痣组织的(1.01±0.13), 差异有统计学意义(t=27.630,P<0.05); CMM组织中SOX13mRNA表达水平为(2.32±0.51), 高于色素痣组织的(1.05±0.11), 差异有统计学意义(t=19.012,P<0.05)。

2.2 CMM组织与色素痣组织SOX13蛋白表达水平比较

免疫组织化学染色结果显示, CMM组织中SOX13蛋白阳性表达率为59.02%, 色素痣组织中SOX13蛋白阳性表达率为13.11%。CMM组织中SOX13蛋白阳性表达率高于色素痣组织，差异有统计学意义(P<0.05), 见图1、表2。

A: 色素痣组织中SOX13阴性表达; B: CMM组织中SOX13阳性表达。

2.3 CMM组织中miR-185-5p与SOX13 mRNA的相关性

表2 SOX13蛋白在CMM组织与色素痣组织中的表达

Pearson相关性分析显示, CMM组织中miR-185-5p与SOX13mRNA表达呈负相关(r=-0.635,P<0.05), 见图2。生物信息学软件TargetScan预测发现, miR-185-5p与SOX13存在靶向结合位点，见图3。

图2 CMM组织中miR-185-5p与SOX13 mRNA的相关性

图3 生物信息学软件TargetScan预测miR-185-5p与SOX13的靶向结合位点

2.4 miR-185-5p、SOX13与CMM临床病理特征的关系

根据miR-185-5p在CMM组织中表达水平，将CMM患者分为miR-185-5p高表达组(miR-185-5p表达水平≥0.47)31例和miR-185-5p低表达组(miR-185-5p表达水平<0.47)30例。根据SOX13蛋白在CMM组织中的表达结果，将CMM患者分为SOX13阳性表达组36例和SOX13阴性表达组25例。结果发现, miR-185-5p、SOX13表达与浸润程度和淋巴结转移有关(P<0.05), 与患者性别、年龄、肿瘤直径、发病部位和肿瘤分期无关(P>0.05), 见表3。

表3 miR-185-5p、SOX13与CMM临床病理特征的关系[n(%)]

2.5 Kaplan-Meier生存分析

对所有患者随访36个月, Kaplan-Meier生存曲线分析显示, miR-185-5p高表达组3年生存率为65.55%, miR-185-5p低表达组3年生存率为37.78%, miR-185-5p高表达组3年生存率高于miR-185-5p低表达组，差异有统计学意义(χ2=5.871,P=0.015); SOX13阳性表达组的3年生存率为38.12%, SOX13阴性表达组3年生存率为65.87%, SOX13阳性表达组3年生存率低于SOX13阴性表达组，差异有统计学意义(χ2=5.030,P=0.020), 见图4。

A: miR-185-5p高表达和miR-185-5p低表达患者累计生存曲线; B: SOX13阴性表达和SOX13阳性表达患者累计生存曲线。

2.6 CMM患者预后影响因素分析

单因素和多因素Cox分析结果显示，淋巴结转移、SOX13是CMM患者不良预后的独立危险因素(P<0.05), miR-185-5p是CMM患者不良预后的保护因素(P<0.05), 见表4。

表4 影响CMM患者预后的单因素和多因素Cox分析结果

3 讨 论

miR-185-5p定位于染色体q11.21, 在调控肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、上皮间质转化、血管生成、肿瘤耐药性等过程中发挥重要作用[7]。多项研究[8-10]显示, miR-185-5p在胰腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤中低表达。CHEN X G等[11]研究表明，长链非编码RNA UCA1通过靶向miR-185-5p的表达调控Wnt/β-catenin信号通路，抑制黑色素瘤的生长与侵袭。YIN C G等[12]研究表明, miR-185-5p在乳腺癌组织与细胞中呈低表达，与肿瘤直径、肿瘤分化和淋巴结转移呈负相关, miR-185-5p可通过调节晚期糖基化终产物特异性受体抑制F-actin聚合并逆转人乳腺癌细胞的上皮间质转化。本研究检测了miR-185-5p在CMM组织中表达，结果发现, CMM组织中miR-185-5p表达水平低于色素痣组织，提示miR-185-5p可能与CMM的发生有关，其机制可能与miR-185-5p参与调控肿瘤细胞的增殖有关。进一步分析显示, miR-185-5p表达与患者性别、年龄、肿瘤直径、发病部位和肿瘤分期无关，与浸润程度和淋巴结转移有关，提示miR-185-5p可能参与CMM的发生与进展过程。

SOX家族转录因子参与调控胚胎发育与细胞生理功能。研究[13]报道,SOX基因家族成员，如SOX2、SOX4与肿瘤的发生有关。SOX13是SOX家族成员之一，参与中枢神经系统发育、糖尿病及胆汁性肝硬化等生理病理过程[14]。SOX13的异常表达还与肿瘤的发生有关，其可促进胰腺癌的侵袭与进展[15]。SOX13在肝癌中表达上调，与肝癌患者的不良预后有关, SOX13参与维持肝癌细胞的癌干样特性，并在肝癌的发展中发挥关键作用[16];SOX13在人胃癌组织中的表达上调，与患者预后相关，且SOX13的表达上调可显著促进胃癌细胞的增殖[17]。本研究结果显示, CMM组织中SOX13mRNA表达水平及蛋白阳性表达率高于色素痣组织，且与CMM的浸润程度和淋巴结转移有关，提示SOX13可能在CMM发生、发展过程中发挥促癌作用。

本研究还发现, CMM组织中miR-185-5p表达水平与SOX13mRNA表达呈负相关，且生物信息学软件TargetScan预测发现, miR-185-5p与SOX13存在靶向结合位点，提示miR-185-5p与SOX13可能通过靶向调控关系参与CMM的发生、发展。本研究的Kaplan-Meier生存曲线分析可知, miR-185-5p高表达患者3年生存率高于miR-185-5p低表达患者, SOX13阳性表达患者3年生存率低于SOX13阴性表达患者，提示miR-185-5p、SOX13与CMM患者预后相关。Cox回归模型分析显示，淋巴结转移、SOX13是CMM患者不良预后的独立危险因素, miR-185-5p是CMM患者不良预后的保护因素，进一步提示miR-185-5p、SOX13可能作为评估CMM患者预后不良的标志物。

综上所述, CMM组织中miR-185-5p呈低表达, SOX13呈高表达，且均与CMM患者临床病理特征和预后有关，可能作为CMM潜在的预后标志物，但两者的具体作用机制需要结合细胞模型或动物模型进行进一步研究。