扬子鳄不同组织中褪黑素受体MT1的表达

蔡慧慧

（合肥诺为尔基因科技服务有限公司，安徽合肥 230000）

褪黑激素主要是由松果体合成分泌的一种激素，其化学结构为N-乙酰-5-甲氧基色胺，在动物的生殖、生物钟、免疫、抗自由基等方面都有重要影响。褪黑激素受体（Melatonin Receptor，MELR）属于G蛋白耦联受体家族，人和其他哺乳动物的褪黑素受体共3种亚型，分别为MT1、MT2和MT3。褪黑素可与其受体特异性结合从而发挥作用，其主要作用部位一般认为是脑、垂体和视网膜。褪黑素也作用于动物的外周组织，在小鼠的心脏、肺、肝脏和肾脏等多个外周组织发现MT1受体的存在[1]。赵劲松等[2]报道MT1受体在无蹼壁虎的肝脏中表达。非洲鸵鸟的卵巢、豚鼠和鸭子的肾脏以及人的外周血淋巴细胞中也发现了特异的MELR[3]。本文研究扬子鳄性腺、胸腺和脾脏中褪黑素受体MT1的表达和分布，探讨褪黑素对于扬子鳄的季节性生殖及免疫调节机制的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用鳄为成年扬子鳄，分别于2011年8月15日、2011年10月21日和2012年1月5日捕获成年雄鳄1条，解剖取其睾丸；分别于2011年9月23日、2012年3月21日和2012年7月6日捕获成年雌鳄1条，解剖取其卵巢，同时取其胸腺和脾脏等。所有组织均切成小块，浸入Bouin’s液中固定24 h，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片，厚度为5 μm。实验所用扬子鳄均取自安徽省扬子鳄繁育研究中心。

1.2 主要试剂

浓缩型兔抗人、兔、大鼠、小鼠等褪黑素受体多克隆抗体，即用型SABC（兔IgG）试剂盒，DAB显色试剂盒，抗体稀释液，以上试剂均购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 实验方法

石蜡切片常规脱蜡至水后，放入新鲜配制的3%过氧化氢（H2O2）处理10 min 以抑制内源性过氧化物酶活性。ddH2O洗3次，每次2min。抗原热修复10 min，暴露易被固定破坏的抗原。PBS洗2次，每次2 min。5%BSA封闭液处理，室温20 min，以减少非特异性背景。去除多余液体，不洗，滴加一抗，4 ℃孵育过夜（18h），第一抗体为浓缩型兔抗人、兔、大鼠、小鼠褪黑素受体等多克隆抗体（Melatonin Receptor la，Mel1a，1∶100稀释）。PBS洗3次，每次2 min。滴加生物素化羊抗兔IgG，室温20 min。PBS洗3次，每次2min。DAB显色。ddH2O洗3次，每次2 min。苏木精轻度复染。ddH2O洗3次，每次 2 min。脱水，透明，封片。免疫组织化学法阴性对照，用PBS代替一抗，其余步骤同上。

2 结果与分析

2.1 褪黑素受体在扬子鳄性腺中的表达

由图1可知，在扬子鳄性腺中，免疫阳性反应位点主要存在于3月卵巢和7月卵巢的滤泡细胞层和生殖上皮，9月卵巢的滤泡细胞的细胞核以及1月精巢和10月精巢的精原细胞和精母细胞，8月精巢的精原细胞、精母细胞和间质细胞。其中，7月卵巢的MT1免疫阳性反应物存在于滤泡细胞的细胞膜和细胞质，细胞核均呈阴性；而9月卵巢中，其免疫阳性反应物存在于滤泡细胞的细胞核，且细胞核完全被染成棕黄色，其细胞质和细胞膜均呈阴性。在不同月份精巢中的分布也具有不同的特点：1月精巢中褪黑素受体呈现出团状聚集分布，且为细胞膜和细胞质染色；10月精巢的MT1阳性反应物主要位于细胞核，呈颗粒状，且为散在不均匀分布。

图1 MT1免疫阳性定位在扬子鳄不同组织的显示图（400×）

2.2 褪黑素受体在扬子鳄胸腺中的表达

由图2可知，扬子鳄胸腺中存在褪黑素受体阳性反应位点。胸腺组织中的免疫阳性反应定位于淋巴细胞的细胞膜和细胞质，细胞核呈阴性。

图2 MT1免疫阳性定位在胸腺的淋巴细胞（400×）

2.3 褪黑素受体在扬子鳄脾脏中的表达

由图3可知，扬子鳄脾脏中存在褪黑素受体阳性反应位点。脾脏中的免疫阳性反应定位于淋巴细胞的细胞核。

图3 MT1免疫阳性定位在脾的淋巴细胞（400×）

3 讨论

3.1 褪黑素受体在扬子鳄性腺中的表达

研究表明，在鸟类和一些哺乳类动物附睾、睾丸和卵泡的颗粒细胞上存在褪黑素受体。MT1广泛存在于非洲鸵鸟卵巢中，在每一级卵泡的生殖上皮、卵泡细胞层、卵母细胞的细胞质以及间质细胞均有表达[4]。本研究对不同月份的扬子鳄性腺中的褪黑素受体进行鉴定，结果提示，褪黑素受体的分布可能存在组织间差异和季节性差异，褪黑素对动物的生殖功能具有一定的调节作用。这种调节作用，既可以通过与MT1膜受体接合经G蛋白信号转导途径，也可能通过与MT1质受体或核受体结合激活相应的信号途径发挥生理效应。

3.2 褪黑素受体在扬子鳄胸腺和脾脏中的表达

胸腺是免疫系统的重要组成部分，免疫系统外周成分的发育成熟有赖于正常的胸腺功能。研究发现，切除松果体会导致胸腺加速退化，而注射松果体提取物却促进胸腺增生，已证实这些效应与松果体分泌的褪黑素有关。褪黑素对脾脏同样有作用。将25 μg褪黑素经皮下注射给叙利亚仓鼠，持续10周，结果发现实验鼠的脾脏相对或绝对重量增加，且髓外造血功能得到了加强。不同的光照周期也可影响脾脏重量。长光照（14∶10）与短光照（10∶14）周期相比，前者使脾脏明显减轻，并使脾脏中淋巴细胞与巨噬细胞的数量明显减少[5]。

应用放射配体结合法检测大鼠、小鼠、仓鼠、鸡、鸭、鸽子和鹌鹑的胸腺、腔上囊及脾脏的褪黑素特异结合位点，结果显示鸟类及鼠类免疫器官均存在褪黑素特异结合位点，并鉴定为褪黑素受体，证实免疫组织是褪黑素作用的靶器官，褪黑素对免疫系统的调节作用是通过免疫组织上褪黑素受体直接作用的结果[6-8]。与上述测定结果一致，扬子鳄胸腺和脾脏中均存在褪黑素受体阳性反应位点，说明扬子鳄胸腺和脾脏是褪黑素作用的靶器官，褪黑素能与扬子鳄胸腺和脾脏淋巴细胞的MT1受体相结合，直接调节免疫系统的功能，而非通过阿片受体等间接作用。

4 结论

利用免疫组织化学法对褪黑素受体在扬子鳄不同组织中的分布进行了一定的研究。结果表明，在扬子鳄不同月份的卵巢、精巢以及胸腺和脾脏中均存在褪黑素受体。在扬子鳄性腺和免疫器官中检测到褪黑素受体的存在，说明性腺和免疫器官是褪黑素作用的靶器官。褪黑素对扬子鳄生殖、免疫等生理功能的影响是通过与其靶组织器官中的受体相结合，进而直接参与调控作用的结果。