嗜热侧孢霉液体发酵对玉米秸秆中纤维素降解的影响

任鸿莉，欧阳小琪，陈晓健，周馨玥，张琦，夏文静

（南京师范大学泰州学院，江苏泰州 225300）

中国是农业大国，每年农作物秸秆产量大约是7.8亿t，秸秆种类丰富，其中玉米秸秆的产量大约是2.4亿t[1]。秸秆是丰富的可再生资源，秸秆还田是当今普遍重视的一项培肥土地的措施。秸秆还田不仅可以培肥土地、增加土壤有机质、提高作物产量，还可用来制作饲料和用作其他副产品生产[2]。秸秆资源化利用中，本身纤维素含量高，自然降解的速度非常缓慢，因此提高降解效率是秸秆利用的核心问题。

现有的加快纤维素降解方法有化学法、物理法和生物法。化学法以酸化、碱化、有机溶剂处理和离子液处理为代表[3]。其中酸处理对容器的要求较高，需要耐腐蚀的容器，预处理后还需要中和酸，酸处理还会产生大量的副产品，不利于后续反应。碱处理消耗大，且还需要中和、洗涤、回收等步骤。物理法以蒸汽爆破和高温高压处理为主，但设备投资较大，能耗也很大，不符合经济环保的宗旨。生物法具有能耗低、无污染、降解速率高和成本低等优势[4-5]。目前降解纤维素的菌有木霉、根霉、青霉和曲霉等[6]。张彦庭和马一[7]筛选出的菌株1号（初步鉴定为瑞氏木霉）和菌株2号（初步鉴定为瑞氏木霉）在30 ℃对纤维素的降解率达到16.18%和52.45%。刘最等[8]筛选的菌株1-4（冬克青霉）在28 ℃连续培养21 d后，纤维素含量由30.00%减少至26.36%。邢慧珍等[9]研究的草酸青霉菌在10 ℃培养15 d对玉米秸秆的降解率为39.5%。关于嗜热侧孢霉的相关研究较少，嗜热侧孢霉是对纤维素有高效降解能力的一类丝状真菌[10]。该菌具有耐高温的特点，秸秆在堆肥时的温度较高，故该菌对纤维素降解有着独特的优势。本文主要研究不同发酵因素对嗜热侧孢霉对玉米秸秆的降解效率的影响，以期为高效利用玉米秸秆提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

嗜热侧孢霉，由南京师范大学泰州学院微生物实验室提供；玉米秸秆，购自路路家庭农场。

葡萄糖、柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、乙二胺四乙酸二钠、四硼酸钠、十二烷基硫酸钠、乙二醇乙醚、十六烷基三甲基溴化铵、浓硫酸和丙酮，均为分析纯，购自国药集团；马铃薯葡萄糖琼脂（PDA），上海博微生物科技有限公司。

1.2 仪器

FA2004电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；UV1000紫外可见分光光度计，尤尼柯仪器有限公司；QWZY-X3组合式摇床，太仓市强文实验设备有限公司；SX2-5-12马弗炉，上海雷韵试验仪器制造有限公司；LK-SJH-4S恒温水浴锅，上海硕光电子科技有限公司；MLS-3780高压蒸汽灭菌锅，日本SANYO公司；SW-CJ-1F超净工作台，苏州智净净化设备有限公司；LRH-150F生化培养箱，上海天呈实验仪器制造有限公司。

1.3 培养基的配制

液体发酵培养基配制：葡萄糖1.000 0 g，硫酸镁0.029 2 g，硫酸铵2.000 0 g，磷酸氢二钾0.100 0 g，pH值5.0，用蒸馏水定容至1 L；玉米秸秆2.000 0 g/瓶，121 ℃灭菌 20 min。

PDA培养基配制：称取39 g的马铃薯葡萄糖琼脂粉，加蒸馏水加热煮沸溶解，定容到1 L，经过121 ℃灭菌15 min以后备用。

1.4 实验方法

1.4.1 纤维素含量的测定

本实验对玉米秸秆中纤维素含量测定采用范式（VanSoest）分析方法[11]。ADF为酸性洗涤纤维素含量，ADL为酸不溶木质素含量，纤维素含量的计算公式如（1）所示：

将发酵液在10 000 r/min离心10 min，去上清，收集沉淀；将沉淀用蒸馏水清洗3次，烘干后按照式（1）测定其纤维素含量。降解率的计算如式（2）所示：

式中：S1、S2分别为玉米秸秆降解前和降解后的纤维素含量，%。

1.4.2 菌种活化

将嗜热侧孢霉涂布于PDA固体培养基上，于45 ℃培养箱中培养3 d，之后将菌丝体接种到液体发酵培养基中培养24 h活化。

1.4.3 秸秆预处理

将玉米秸秆用剪刀初步剪碎，放在90 ℃烘箱中1 h；取烘干后秸秆，用粉碎机粉碎，过100目筛，筛下物即为玉米秸秆粉，放在密封袋中保存备用。

1.4.4 嗜热侧孢霉对玉米秸秆降解的条件优化

（1）发酵时间对玉米秸秆中纤维素降解率的影响。将嗜热侧孢霉接种到液体发酵培养基中，接种量为2%，装液量为100 mL/250 mL，在40 ℃、150 r/min的条件下培养，在第2 d、4 d、6 d和8 d和10 d分别取样，测定秸秆中纤维素的含量并计算降解率，每个样品做3个平行样。

（2）发酵液初始pH值对玉米秸秆中纤维素降解率的影响。将液体发酵培养基的pH值分别调节到4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，接种量为2%，装液量为100 mL/250 mL，在40 ℃、150 r/min的条件下培养8 d，测定秸秆中纤维素的含量并计算降解率，每个样品做3个平行样。

（3）接种量对玉米秸秆中纤维素降解率的影响。将液体发酵培养基的pH值调到6.5，装液量为100 mL/250 mL，按照1%、2%、3%、4%和5%的接种量进行接种，将接种后的培养基在40 ℃、150 r/min的条件下培养8 d，测定秸秆中纤维素的含量并计算降解率，每个样品做3个平行样。

（4）发酵温度对玉米秸秆中纤维素降解率的影响。将液体发酵培养基的pH值调到6.5，装液量为100 mL/250 mL，接种量为2%，转速为150 r/min，分别在 35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和 60 ℃的条件下培养8 d，测定秸秆中纤维素的含量并计算降解率，每个样品做3个平行样。

（5）装液量对玉米秸秆中纤维素降解率的影响。将液体发酵培养基的pH值调到6.5，接种量为2%，转速为150 r/min，250 mL的三角瓶中分别装入50 mL、100 mL、150 mL和200 mL培养基，在45 ℃的条件下培养8 d，测定秸秆中纤维素的含量并计算降解率，每个样品做3个平行样。

（6）转速对玉米秸秆中纤维素降解率的影响。将液体发酵培养基的pH值调到6.5，装液量为150 mL/250 mL，接种量为2%，将培养箱的转速分别调到 100 r/min、125 r/min、150 r/min、175 r/min、200 r/min和225 r/min进行培养，在8 d测定秸秆中纤维素的含量并计算降解率，每个样品做3个平行样。

1.5 数据处理

采用SPSS软件对数据进行单因素方差分析（ANOVA），利用最小显著性差异法（Least—Significant Difference，LSD）法进行不同处理之间的多重比较，P＜0.05为差异显著，再用Origin 8.0对数据进行作图。

2 结果与分析

2.1 发酵时间对玉米秸秆中纤维素降解率的影响

由图1可知，随着培养时间的延长，玉米秸秆的降解率在逐渐升高，在第8 d时降解率达到了23.58%，第10 d时降解率为23.28%，两者无显著性差异，因此确定最佳的培养时间为8 d。

图1 发酵时间对玉米秸秆中纤维素降解率的影响

2.2 发酵液初始pH值对玉米秸秆中纤维素降解率的影响

由图2可知，随着pH值的升高,降解率呈上升的趋势，当pH值达到6.5时降解率为26.51%，但随后降解率呈下降趋势。嗜热侧孢霉产纤维素酶的最佳pH值为6.5，且该纤维素酶在pH值6.5时的稳定性较好，故选择pH值6.5作为降解的最佳pH值。

图2 发酵液初始pH值对玉米秸秆中纤维素降解率的影响。

2.3 接种量对玉米秸秆中纤维素降解率的影响

由图3可知，在接种量为2%时降解率达到了26.51%，当接种量超过2%时，降解率呈下降趋势，原因可能是随着接种量的增加，培养基中的营养物质也随之消耗，且代谢废物积累也越来越多，菌体营养得不到满足，生长会受到抑制，进而影响到纤维素酶的产量，秸秆中纤维素的降解效果也会受到影响。因此，选择最佳接种量为2%。

图3 接种量对玉米秸秆中纤维素降解率的影响

2.4 发酵温度对玉米秸秆中纤维素降解率的影响

由图4可知，在35～45 ℃，玉米秸秆的纤维素降解率随温度的升高而不断升高，在45 ℃时降解率达到最高29.47%，但之后降解率随温度的升高而呈下降的趋势，在60 ℃时降解率降至3.21%。由此可见温度对玉米秸秆的降解率影响较大，这是因为温度对酶的活性有较大的影响，温度过高会使酶失去活性进而导致降解率的降低。因此，选择45 ℃为最佳的降解温度。

图4 发酵温度对玉米秸秆中纤维素降解率的影响

2.5 装液量对玉米秸秆中纤维素降解率的影响

由图5可知，随着装液量的升高秸秆中纤维素的降解率呈上升趋势，当装液量为150 mL、200 mL时降解率分别为32.36%、31.93%，二者无显著性差异，因此从经济的角度出发，应选择150 mL的装液量为最佳。

图5 装液量对玉米秸秆中纤维素降解率的影响

2.6 转速对玉米秸秆中纤维素降解率的影响

由图6可知，随着培养箱转速的提高，秸秆的降解率也逐渐升高，当转速为200 r/min时玉米秸秆的降解率最高为35.23%，转速为225 r/min时降解率为35.07%，两者无显著性差异。这是因为转速越高，培养基中的溶解氧越高，菌体生长较快，产酶量也会随之增加，对秸秆的降解效率越好，因此选择最佳转速为200 r/min。

图6 转速对玉米秸秆中纤维素降解率的影响

除转速外，单因素实验2.6的条件均是前述各单因素实验的最佳条件，因此转速为200 r/min的实验组条件即为最优工艺组合，即发酵时间8 d、发酵pH值6.5、接种量2%、发酵温度45 ℃、装液量150 mL、转速200 r/min是玉米秸秆降解的最佳条件，在此条件下玉米秸秆的降解率为35.23%，较优化前（2.1）提高了78.11%。

3 结论

对于利用微生物来降解玉米秸秆，现在越来越受到关注。郭红伟等[12]研究了木质纤维素酶高产菌株的筛选及其对玉米秸秆降解效果的影响，降解率为20.00%；孙捷等[13]研究了离子液体辅助纤维素酶降解小麦秸秆，降解率为10.42%。本实验所研究的嗜热侧孢霉对玉米秸秆的降解率达35.23%。较前人研究的降解率高，说明嗜热侧孢霉对玉米秸秆的降解效果要好。同时，由于秸秆中化学结构复杂，单一的微生物产生水解酶的种类和数量有限，因此对秸秆的降解能力也有限，所以利用多种菌种协同处理秸秆提高降解率也慢慢被大众所推崇。如王益等[14]就把嗜热侧孢霉与白腐真菌复配起来研究其对秸秆的降解，降解率达62.61%。因此，在今后的研究中也应采用复合菌系来降解秸秆。

通过单因素实验得出嗜热侧孢霉降解玉米秸秆的最佳发酵时间为8 d，最佳发酵pH值为6.5，最佳接种量为2%，最佳发酵温度为45 ℃，最佳装液量为150 mL，最佳转速为200 r/min。