云南省发现越南趾沟蛙

杨 云 刘小龙 饶静秋 贺艳红 韩克国 王 剑 袁智勇*

(1.西南林业大学，云南省高校极小种群野生动物保育重点实验室，昆明，650224；2.文山市国家级自然保护区管护分局，文山，663099；3.红河学院生命科学与技术学院，蒙自，661199)

越南趾沟蛙(Ranajohnsi)隶属于两栖纲(Amphibia)无尾目(Anura)蛙科(Ranidae)蛙属[1]，是Smith[2]发表的新种，模式产地为越南林同省郎边高原(Langbian Plateau，Lam Dong，Vietnam)。目前该蛙在国内分布于广西、广东、海南和重庆，国外分布于越南和老挝[3-5]。2019年7月，在云南省文山壮族苗族自治州马关县古林箐省级自然保护区对两栖爬行动物调查期间，于保护区核心区(22°45′16.36″ N，103°57′43.17″ E；海拔1 160 m)内发现蛙属物种6只，采集到蛙属物种标本1号(标本号：SWFU 005647)，标本现保存于西南林业大学。对采集的蛙属物种标本进行了外部形态特征比较和分子系统发育关系分析，鉴定该物种为越南趾沟蛙，为云南两栖动物分布新纪录。本研究进行了采集地生境描述、形态描述和分子数据及系统发育分析，为进一步探讨越南趾沟蛙的分布情况提供基础研究资料。

1 材料与方法

1.1 样本采集

将采集到的蛙属物种雄性标本(标本号：SWFU 005647)的肝脏样品储存在体积分数95%的乙醇中，用于后续的分子试验。整体标本固定保存在体积分数75%的乙醇中。

1.2 形态学测量

依据费梁等[4]的测量方法，用数显卡尺对标本进行形态学测量，精确到0.1 mm。测量指标：头体长(snout-vent length，SVL)，自吻端至体后端的长度；头长(head length，HL)，自吻端至上、下颌关节后缘的长度；头宽(head width，HW)，最大头部宽度；吻长(snout length，SL)，自吻端至眼前角的长度；鼻间距(internasal space，INS)，左右鼻孔内缘之间的距离；眼间距(interorbital space，IOS)，左、右上眼睑内侧缘之间的最窄距离；眼径(diameter of eye，ED)，与体轴平行的眼球外露部分的直径；上眼睑宽(width of upper eyelid，UEW)，上眼睑最大宽度；鼓膜径(diameter of tympanum，TD)，鼓膜的水平直径，测量到鼓膜边缘的外缘；鼓膜到眼距离(tympanum-eye distance，TEY)，自眼孔的后缘至鼓膜的前缘；前臂及手长(length of lower arm and hand，LAHL)，自肘关节至Ⅲ指指尖；股骨长度(femur length，FEM)；胫骨长(tibia length，TIB)；跗足长(length of the foot and tarsus，LFT)，从胫跗关节到Ⅳ趾趾尖；足长(foot length，FL)，从跖骨内结节基部至Ⅳ趾趾尖；第Ⅲ指指吸盘的水平直径(the horizontal diameter of the finger Ⅲ digital disc，F3DSC)。

1.3 分子系统发育分析

采用ThermoFisher Scientific公司DNA提取试剂盒提取标本的DNA，-20 ℃保存备用。使用引物16S AR(5′-CGCCTGTTTACCAAAAACAT-3′)和16S BR(5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′)[6]，对16S rRNA基因片段进行扩增。PCR反应程序为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性40 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃终延伸10 min。扩增的PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，最后送至北京擎科生物科技有限公司测序。使用Lasergene 7.0软件包中的SeqMan对所得序列进行质量检测和人工校对，生成一致序列。

根据Yuan等[7]对整个蛙属的系统发育研究结果，选择黄腿蛙(Ranamuscosa)作为外群，从GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载越南趾沟蛙(KX269182)、明全蛙(R.zhengi，KX269206)、中亚林蛙(R.asiatica，KX269200)、黑龙江林蛙(R.amu-rensis，KX269203)和黄腿蛙(AY779195)序列。基于最大似然法(ML)和贝叶斯法(BI)重建系统发育关系。采用MEGA 7.0[8]和Clustal W 2.0[9]对所有序列进行比对，用jModelTest 0.1.1计算最佳替换模型，使用RaxML 8.2.4版本运行最大似然估计[10]。在ML分析下使用非参数自助重取样重复1 000次来评估自引支持度。使用Mrbayes 3.1.2进行贝叶斯系统发育分析[11]，通过让4条递增加热的马尔科夫链运行3 000万代，每1 000代抽样1次，得出后验概率分布。基于收敛情况，舍弃前25%的树。使用Tracer v1.5检测各运行参数值是否收敛[12](有效样本量大于200和潜在的尺度缩减因子值接近1来保证收敛)。最后使用MEGA 7.0[8]中的p-distance双参数模型计算蛙属物种间的遗传距离。

2 结果与分析

2.1 生境描述

古林箐省级自然保护区属于南亚热带湿润季风气候[13-14]，本次在云南省马关县采集的1号越南趾沟蛙标本，发现于海拔1 160 m左右的山间溪流内，溪流水流缓慢，溪中有一些石块。附近植被丰富，主要以灌木、草本植物和喀斯特地貌常绿阔叶林为主，间有小面积的低海拔热带雨林成分(图1)。同域生境下发现的两栖动物还有腹斑掌突蟾(Paramegophrysventripunctatus)、白斑棱皮树蛙(Thelodermaalbopunctatum)、版纳大头蛙(Limnonectesbannaensis)和沙巴琴蛙(Nidiranachapaensis)。

2.2 形态描述

采集的越南趾沟蛙头体长38.3 mm，其余各部位量度数据见表1。头长大于头宽；吻端钝圆，突出于下唇；瞳孔横椭圆形，眼间距略小于上眼睑宽；鼓膜清晰；犁骨齿呈两斜列。背面光滑，背侧褶细，到鼓膜上方略弯曲；体背后部有小疣粒；体腹面光滑(图2)。

表1 越南趾沟蛙标本形态量度

指端略膨大，无沟；后肢细长，胫跗关节前伸达吻鼻之间或略超过吻端，左、右跟部重叠；胫长超过体长之半，明显长于股部长；跗褶部位有小疣，趾端呈小吸盘状，腹侧具沟，趾间全蹼，蹼缘缺刻深。背面褐色，两眼间有一深褐色横纹，肩上方有“人”形褐色斑；四肢背面有深褐色横纹；体腹面浅黄色，胸、腹部有深色的云斑(图2)。

图2 越南趾沟蛙(云南省古林箐省级自然保护区，)Fig.2 Rana johnsi from Gulinqing Provincial Nature Reserve，Yunnan，China() 注：A.背侧面；B.背面；C.腹面 Note：A，Dorsolateral view.B，Dorsal view.C，Ventral view

指长顺序为Ⅱ<Ⅰ<Ⅳ<Ⅲ，指基部有指基下瘤，指间无蹼，关节下瘤突出；掌突3个，椭圆形，第Ⅱ指掌突略圆，较弱小。趾长顺序为Ⅰ<Ⅱ<Ⅲ<Ⅴ<Ⅳ，趾间蹼发达，关节下瘤明显；内蹠突椭圆形，外蹠突圆而小；跗褶部位具小疣(图3)。

图3 越南趾沟蛙手部及足部形态(云南省古林箐省级自然保护区，)Fig.3 Hands and foots of Rana johnsi from Gulinqing Provincial Nature Reserve，Yunnan，China() 注：A.手背面；B.手腹面；C.足背面；D.足腹面 Note：A，Dorsal view of hand.B，Ventral view of hand.C，Dorsal view of foot.D，Ventral view of foot

2.3 分子数据及系统发育分析

新获取1条序列(GenBank登录号OK037567)，比对后序列长度580 bp，变异位点57个和简约信息位点23个，系统发育的结果显示，BI和ML树的拓扑结构基本相同。在文山马关县采集的蛙属物种样本与越南林同省的越南趾沟蛙样本聚成单系(图4)，支持率高(100%)。基于p-distance双参数模型估算的新采集样本与越南趾沟蛙的遗传距离为0.8%。

3 讨论

在云南文山州古林箐省级自然保护区采集到的越南趾沟蛙标本与越南郎边高原的该蛙模式标本在外部形态描述上基本一致，同时系统发育分析的结果显示，采集的标本与模式标本聚为一个支系，遗传距离非常小(0.8%)。基于以上结果，证实了越南趾沟蛙在云南省文山州马关县的分布。本研究采集到的雄性标本头体长较模式标本小(头体长分别是38.3 mm和49.0 mm)[2]，且背部体色和腹部体色较深。越南趾沟蛙在云南马关县古林箐自然保护区的发现，提示与相邻的广西、越南地区有相似的物种组成，对动物地理学研究有重要意义。越南趾沟蛙的繁殖季节在8月下旬—9月下旬[3-4]，研究人员于2019年7月29日在古林箐保护区采集标本时，未发现其抱对现象，由于考察时间较短，不确定该蛙是否进入繁殖期，繁殖生活史需进一步研究。

致谢：感谢西南林业大学魏平凡和密歇根州立大学张寅鹏同学在文章撰写过程中给予的帮助。