LncRNA FGD5-AS1靶向 miR-106a-5p减轻ox-LDL诱导的HUVECs损伤

郭 婧，李亚洁，牟寒霜

(宝鸡市中心医院 1.心血管内科； 2.全科医学科, 陕西 宝鸡 721000)

动脉粥样硬化(atherosclerosis)是一种血管壁炎性疾病，血管内皮细胞在调控血管功能与维持血管内环境中均具有重要意义，氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)是促使动脉粥样硬化发生的危险因素，ox-LDL可诱导血管内皮细胞氧化应激而引起细胞凋亡进而导致动脉粥样硬化的发生[1-2]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一种与多种疾病有关的内源性长链非编码RNA分子，其可充当微小RNA(microRNA,miRNA)竞争内源性RNA分子而在转录水平上调控靶基因表达，lncRNA在ox-LDL诱导的血管内皮细胞中表达异常，并可能参与动脉粥样硬化的发生及发展过程[3-4]。LncRNA FGD5-AS1(FYVE, RhoGEF, and PH domain containing 5 antisense RNA 1)在牙周膜患者中低表达，上调其表达可通过调节miR-142-3p/SOCS6/NF-κB途径抑制LPS诱导的牙周膜细胞损伤[5]。生物信息学预测显示FGD5-AS1与miR-106a-5p存在结合位点，研究表明miR-106a-5p在ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤中表达上调，干扰其表达可减轻细胞损伤[6]。但FGD5-AS1/miR-106a-5p分子轴在动脉粥样硬化发生过程中的作用机制尚未阐明。因此，本研究采用ox-LDL诱导人脐静脉血管内皮细胞建立细胞损伤模型，探讨FGD5-AS1是否可通过靶向调控miR-106a-5p而参与ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤过程。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)(ATCC公司)；Ox-LDL(北京索莱宝科技有限公司)；Lipofectamine2000(Invitrogen公司)；Trizol试剂(北京全式金生物技术有限公司)；反转录试剂与荧光定量PCR试剂(北京天根生化科技有限公司)；质粒pcDNA3.1(上海远慕生物科技有限公司)；miR-106a-5p 寡核苷酸模拟物(miR-106a-5p mimics)及阴性对照mimic NC序列(miR-NC)、miR-106a-5p特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-106a-5p)及其阴性对照序列(anti-miR-NC)、FGD5-AS1小分子干扰RNA(si-FGD5-AS1)及其阴性对照序列(si-NC)(广州市锐博生物科技有限公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismu-tase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；凋亡检测试剂盒(Sigma-Aldrich公司)；兔抗人cleaved caspase-3、cleaved caspase-9抗体与HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理：血管内皮细胞汇合度达到80%左右时进行传代培养，事先配制浓度为100 ng/L的ox-LDL溶液[7]，ox-LDL干预前进行同步化处理，用ox-LDL干预血管内皮细胞24 h，记为ox-LDL组。同时将正常培养的血管内皮细胞记为Ctrl组。收集ox-LDL处理后的血管内皮细胞，加入培养液调整细胞密度后按照每孔2×103个接种于96孔板，于培养箱内培养，待细胞增殖汇合度达到60%时，分别将pcDNA、pcDNA-FGD5-AS1、anti-miR-NC、anti-miR-106a-5p、pcDNA-FGD5-AS1与miR-NC、pcDNA-FGD5-AS1与miR-106a-5p mimics转染至血管内皮细胞，分别加入含有浓度为100 ng/L的ox-LDL溶液处理24 h，分别记为(ox-LDL+pcDNA)组、(ox-LDL+pcDNA-FGD5-AS1)组、(ox-LDL+anti-miR-NC)组、(ox-LDL +anti-miR-106a-5p)组、(ox-LDL+pcDNA-FGD5-AS1+miR-NC)组、(ox-LDL+pcDNA-FGD5-AS1+miR-106a-5p)组。

1.2.2 RT-qPCR检测FGD5-AS1、miR-106a-5p mRNA表达水平：根据Trizol说明书分别提取血管内皮细胞总RNA，用反转录试剂盒与荧光定量PCR试剂盒分别进行反转录与RT-qPCR实验，用美国ABI StepOnePlus实时荧光定量PCR仪检测基因表达量。FGD5-AS1正向引物5′-AGAAGCGGAGGGGTG AAAAT-3′，反向引物5′-CCGCCTTATAGTTGGCC CTC-3′；miR-106a-5p正向引物5′-GGGGCAAAGTGC TAACAGTG-3′，反向引物5′-GTGCGTGTCGTGGAG TCG-3′；GAPDH正向引物5′-AACGGATTTGGTCGT ATTG-3′，反向引物5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′；U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTA AAT-3′，反向引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTC AT-3′。

1.2.3 检测氧化应激指标MDA、SOD、CAT的含量：收集血管内皮细胞培养上清液，按照试剂盒说明书检测MDA、SOD、CAT的含量。

1.2.4 流式细胞测量术检测细胞凋亡率：取各组血管内皮细胞后加入500 μL结合缓冲液重悬细胞，按照凋亡试剂盒说明书检测细胞凋亡率。

1.2.5 双荧光素酶报告基因检测FGD5-AS1与miR-106a-5p靶向关系：FGD5-AS1与miR-106a-5p存在特异性结合位点，分别构建野生型WT-FGD5-AS1与突变型MUT-FGD5-AS1的荧光素酶报告载体，分别将miR-NC、miR-106a-5p mimics与WT-FGD5-AS1、MUT-FGD5-AS1共转染至细胞，48 h后收集细胞，按照荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书检测其相对荧光素酶活性。

1.2.6 Western blot检测cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白表达：蛋白裂解液后提取细胞总蛋白，按照20 μg总蛋白上样量将蛋白样品加入SDS-PAGE凝胶中，经过垂直电泳后将其转移至PVDF膜，PVDF膜在5%脱脂牛奶中封闭2 h，然后将PVDF膜置于稀释比为1∶1 000的cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、GAPDH一抗中孵育过夜(4 ℃)，TBST洗涤，室温孵育二抗(1∶2 000)1 h，加入显影液后曝光得到cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的蛋白条带，用Image-J软件扫描蛋白条带的吸光度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Ox-LDL诱导的HUVECs损伤中 lncRNA FGD5-AS1和miR-106a-5p mRNA的表达

与Ctrl组比较，ox-LDL组FGD5-AS1 mRNA的表达水平降低(P<0.05)，而miR-106a-5p mRNA的表达水平升高(P<0.05)(表1)。

表1 Ox-LDL诱导的HUVECs中lncRNA FGD5-AS1和miR-106a-5p mRNA的表达

2.2 Ox-LDL对HUVECs损伤的影响

与Ctrl组比较，ox-LDL组MDA的水平、凋亡率和cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白水平升高(P<0.05)，SOD、CAT的活性降低(P<0.05)(图1,表2)。

2.3 LncRNA FGD5-AS1过表达对ox-LDL诱导的HUVECs损伤的影响

与(ox-LDL+pcDNA)组比较，(ox-LDL+pcDNA-FGD5-AS1)组MDA的水平、凋亡率和cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白水平降低(P<0.05)，SOD、CAT的活性增强(P<0.05)(图2,表3)。

2.4 LncRNA FGD5-AS1靶向调控miR-106a-5p的表达

LncBase Predicted v.2预测显示FGD5-AS1与miR-106a-5p存在结合位点(图3)。转染miR-106a-5p mimics可明显降低野生型载体WT-FGD5-AS1的荧光素酶活性(P<0.05)(表4)。与pcDNA组比较，pcDNA-FGD5-AS1组miR-106a-5p的表达下调(P<0.05)；与si-NC组比较，si-FGD5-AS1组miR-106a-5p的表达上调(P<0.05)(表5)。

A.apoptosis-related protein expression; B.apoptosis flow cytometry图1 Ox-LDL对HUVECs凋亡相关蛋白及凋亡率的影响Fig 1 Effect of ox-LDL on HUVECs apoptosis-related proteins and apoptosis rate

表2 Ox-LDL对HUVECs损伤的影响Table 2 Effect of ox-LDL on the damage of

A.apoptosis-related protein expression; B.apoptosis flow cytometry图2 LncRNA FGD5-AS1过表达对ox-LDL诱导的HUVECs凋亡相关蛋白及凋亡率的影响

表3 LncRNA FGD5-AS1过表达对ox-LDL诱导的HUVECs损伤的影响Table 3 Effect of lncRNA FGD5-AS1 over-expression on the damage of HUVECs induced by

图3 FGD5-AS1的序列中含有与miR-106a-5p互补的核苷酸序列Fig 3 Sequence of FGD5-AS1 contains a nucleotide sequence complementary to miR-106a-5p

2.5 抑制miR-106a-5p表达对ox-LDL诱导的HUVECs损伤的影响

与(ox-LDL+anti-miR-NC)组比较，(ox-LDL+anti-miR-106a-5p)组MDA的水平、凋亡率和cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白水平降低(P<0.05)，SOD、CAT的活性增强(P<0.05)(图4，表6)。

表4 双荧光素酶报告基因实验

表5 LncRNA FGD5-AS1调控miR-106a-5p的表达

A.apoptosis-related protein expression; B.apoptosis flow cytometry图4 抑制miR-106a-5p表达对ox-LDL诱导的HUVECs凋亡相关蛋白及凋亡率的影响

表6 抑制miR-106a-5p表达对ox-LDL诱导的HUVECs损伤的影响Table 6 Effect of inhibiting the expression of miR-106a-5p on the damage of HUVECs induced by

2.6 上调miR-106a-5p表达减缓了lncRNA FGD5-AS1过表达对ox-LDL诱导的HUVECs损伤的作用

与(ox-LDL+pcDNA-FGD5-AS1+miR-NC)组比较，(ox-LDL+pcDNA-FGD5-AS1+miR-1 06a-5p)组MDA的水平、凋亡率和cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白水平升高(P<0.05)，SOD、CAT的活性降低(P<0.05)(图5，表7)。

3 讨论

LncRNA在动脉粥样硬化等多种疾病中表达异常，可能作为多种疾病诊断的潜在生物标志物，还可能作为动脉粥样硬化治疗的潜在靶点[8-11]。但FGD5-AS1在动脉粥样硬化中的表达尚未可知。已有研究报道指出，FGD5-AS1在神经元损伤中表达下调，上调其表达可通过充当miR-223的竞争内源性RNA分子而减轻神经元损伤[12]。FGD5-AS1在急性心肌梗死患者和低氧诱导的心肌细胞损伤中下调表达，上调其表达可通过抑制miR-195而减轻低氧诱导的心肌细胞氧化损伤[13]。表明FGD5-AS1高表达可能减轻细胞损伤。本研究结果显示，ox-LDL诱导的血管内皮细胞中FGD5-AS1的表达水平降低，提示FGD5-AS1表达下调可能促进血管内皮细胞损伤。本研究结果显示，ox-LDL诱导的血管内皮细胞中MDA的水平升高，SOD、CAT的活性降低，这与报道结果相似[14]，进一步研究发现，FGD5-AS1过表达可明显降低ox-LDL诱导的血管内皮细胞中MDA的水平，而SOD、CAT的活性增强，提示FGD5-AS1过表达可抑制ox-LDL诱导的血管内皮细胞氧化应激而减轻细胞氧化损伤。氧化应激与细胞凋亡密切相关，细胞凋亡执行因子caspase3被激活后可促使细胞凋亡[15]。本研究结果显示，ox-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡率升高，cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白水平升高，而FGD5-AS1过表达后可明显降低ox-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡率及cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白水平，提示FGD5-AS1过表达可明显抑制ox-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡进而减轻细胞损伤。

A.apoptosis-related protein expression; B.apoptosis flow cytometry

表7 上调miR-106a-5p表达减缓了lncRNA FGD5-AS1过表达对ox-LDL诱导的HUVECs损伤的作用

为进一步探究FGD5-AS1在ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤中的作用机制，本研究证实FGD5-AS1可靶向结合miR-106a-5p，并可充当miR-106a-5p的竞争性内源RNA分子，同时ox-LDL诱导的血管内皮细胞中miR-106a-5p的表达水平升高，提示FGD5-AS1可能通过负向调控miR-106a-5p的表达而发挥作用。研究表明miR-106a-5p在骨关节炎软骨细胞中表达上调，下调其表达可减轻骨关节炎软骨细胞损伤[16]。本研究结果显示，抑制miR-106a-5p表达可明显降低ox-LDL诱导的血管内皮细胞中MDA的水平，而SOD、CAT的活性增强，并可降低细胞凋亡率，提示抑制miR-106a-5p表达可抑制氧化应激及凋亡从而减轻ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤。同时本研究结果显示，上调miR-106a-5p与FGD5-AS1过表达联合处理后ox-LDL诱导的血管内皮细胞中MDA的水平升高，SOD、CAT的活性降低，而凋亡率升高，提示上调miR-106a-5p可拮抗FGD5-AS1过表达对ox-LDL诱导的血管内皮细胞氧化应激及凋亡的作用。

综上所述，ox-LDL诱导的血管内皮细胞中FGD5-AS1的表达下调，而miR-106a-5p的表达上调，FGD5-AS1可竞争性吸附miR-106a-5p而负向调控其表达，FGD5-AS1过表达可通过下调miR-106a-5p而抑制ox-LDL诱导的血管内皮细胞氧化应激及凋亡进而减轻细胞损伤，FGD5-AS1可能作为动脉粥样硬化治疗的潜在靶点，可为进一步了解lncRNA在ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤中的作用提供新方向，还可为动脉粥样硬化的预防及治疗奠定实验基础。