Fc-gammaⅠ型受体在阿尔茨海默病患者和模型小鼠脑皮质的表达

孙健茹，仇文颖，钱晓菁，马 超

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 人体解剖与组织胚胎学系， 北京 100005)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种起病隐匿的进行性神经退行性疾病。AD神经病理特征包括细胞外β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)沉积、神经纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)、神经炎斑块(neuritic plaques, NPs)沉积等[1]。

免疫球蛋白G(immunoglobulin, IgG)Fc受体家族(Fc-gamma receptors, FcγRs)是免疫球蛋白G的受体，介导效应细胞对免疫复合物的反应[2]。其中FcγRⅠ是已知的唯一高亲和力IgG受体。近年研究表明，外周和中枢神经系统神经元中均表达FcγRⅠ[3-5]。中枢神经系统神经元上的FcγRⅠ可以和IgG直接相互作用，发挥神经免疫功能[3]。然而关于中枢神经元FcγRⅠ在AD背景下的表达变化及其在AD发生发展机制中的作用尚未得到明确。本文对AD患者和APP/PS1小鼠中枢神经系统神经元上FcγRⅠ的表达变化进行探究，将为治疗AD提供新的策略和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 人脑组织样本：11例人脑组织样本均来源于国家发育和功能人脑组织资源库(中国医学科学院北京协和医学院)。所有捐献者的具体信息见表1。研究方法由中国医学科学院基础医学研究所机构审查委员会批准(批准编号：009-2014和031-2017)。

1.1.2 动物：SPF级野生型雄性C57小鼠4只、APP/PS1小鼠5只，体质量30～35 g(斯贝福(北京)生物技术有限公司，许可证编号SCXK(京)2019-0010)。该研究项目通过中国医学科学院基础医学研究所伦理审查委员会审查。本研究所有动物的使用和实验操作严格遵循中华人民共和国国家科学技术委员会发布的《实验动物管理条例》，并给予实验动物福利关照。

1.1.3 试剂：小鼠抗Aβ一抗(ALZFORUM公司)；小鼠抗神经元核抗原NeuN一抗和兔抗FcγRⅠ一抗(Abcam公司)；Goat anti-mouse IgG H&L(Alexa Fluor 488)、Goat anti-rabbit IgG H&L(Alexa Fluor 594)荧光标记二抗(Jackson ImmunoResearch 公司)。HRP-linked anti-mouse IgG(#7076S)、HRP-linked anti-rabbit IgG(#7074S)辣根过氧化物酶偶联二抗(Cell signaling公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫荧光染色检测蛋白表达：浸泡于10%的甲醛溶液中的人脑组织样本(额叶皮层)进行冰冻切片(片厚14 μm)。给小鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉。4%多聚甲醛灌流，收集小鼠全脑。进行4%多聚甲醛固定和30%蔗糖溶液脱水后，冰冻切片(片厚14 μm)。正常牛血清室温封闭1 h后，后分别加入荧光二抗(1∶400)，室温孵育1 h，封片后荧光显微镜观察。

1.2.2 Western blot检测：冰冻于-80 ℃的人脑组织样本提取蛋白。给小鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉，分别收集小鼠大脑皮层和小鼠海马低温冻存，提取蛋白。进行SDS-PAGE、转膜和封闭。加入对应一抗后4 ℃过夜。第2天加入二抗，室温孵育1 h。在天能-5800 Multi全自动化学发光系统中显影，并获取图像。利用Image J软件测算图像上条带的吸光度值，进而计算蛋白相对表达量(以β-actin为内参)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 AD人脑皮层中神经元FcγRⅠ的表达变化

AD组和对照组相比，人脑皮层中FcγRⅠ的含量显著减少(P<0.05)(图1A, B)。无论是在对照组还是AD组中，人脑皮层中FcγRⅠ主要表达于神经元，且人脑皮层的绝大多数神经元均表达FcγRⅠ，人脑皮层小胶质细胞也表达FcγRⅠ(图1F)。AD组人脑皮层中表达FcγRⅠ的神经元数量相较于对照组无明显变化(P>0.05)(图1C)；但AD组人脑皮层中表达FcγRⅠ的小胶质细胞数量相较于对照组明显增多(P<0.01)(图1D)。根据以上结果可推断， FcγRⅠ含量降低来源于神经元表达的FcγRⅠ减少。AD组人脑皮层神经元FcγRⅠ的平均荧光强度显著低于对照组(P<0.05)(图1E)，进一步印证了免疫印迹的实验结果。对照组人脑皮层中几乎没有Aβ斑块，而神经病理学诊断为AD的人脑皮层中可见许多明显的Aβ斑块(图1G)。

2.2 APP/PS1小鼠脑皮层中神经元FcγRⅠ的表达变化

与对照组野生型(wild type，WT)小鼠相比，APP/PS1小鼠脑皮层中FcγRⅠ的含量显著减少(P<0.05)(图2A, B)。无论是在WT组还是APP/PS1组的脑皮层中，FcγRⅠ似乎只表达于神经元中，且小鼠脑皮层的绝大多数神经元均表达FcγRⅠ(图2E)。与WT小鼠相比，APP/PS1小鼠脑皮层中表达FcγRⅠ的神经元数量没有明显变化(P>0.05)(图2C)。对照组小鼠脑皮层神经元FcγRⅠ的平均荧光强度显著高于AD组(P<0.05)(图2D)，进一步印证了免疫印迹的实验结果。WT小鼠脑皮层中没有Aβ斑块，而APP/PS1小鼠的脑皮层中可见许多明显的Aβ斑块(图2F)。

3 讨论

到目前为止，已经在小鼠中识别了4种不同类别的FcγRs，即FcγRⅠ、FcγRⅡB、FcγRⅢ和FcγRⅣ；在人类，FcγRs则存在FcγRⅠ、FcγRⅡB、FcγRⅡA、FcγRⅡC、FcγR3A和FcγRⅢB 6种亚型[6]。FcγRⅠ作为唯一的IgG高亲和力受体，能与IgG结合后，通过激活细胞质区域中包含的免疫受体酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)传递活化信号。外周神经元表达FcγRⅠ并发挥重要作用。例如，背根神经节FcγRⅠ参与并影响外周神经病理性疼痛[4]，三叉神经节FcγRⅠ参与过敏性疾病的发生和发展[5]。

A.Western blot was used to analyze FcγRⅠ expression level in control and AD group; B.relative protein expression levels of FcγRⅠ in each group; *P<0.05 compared with control group; C.number analysis of neurons expressing FcγRⅠ in human brain cortex of each group; D.number analysis of microglia expressing FcγRⅠ in human brain cortex of each group; **P<0.01 compared with control group; E.semiquantitative analysis of fluorescence intensity of neuron FcγRⅠ in human brain cortex of each group；**P<0.01 compared with control group; F.co-expression of FcγRⅠ and NeuN in human brain cortex of each group; G.expression of Aβ in AD human brain cortex(bar=50 nm)

A.Western blot was used to analyze FcγRⅠ expression level in WT and APP/PS1 group; B.relative protein expression levels of FcγRⅠ in each group; *P<0.05 compared with WT group; C.number analysis of neurons expressing FcγRⅠ in mouse brain cortex of each group; D.semiquantitative analysis of fluorescence intensity of neuron FcγRⅠ in mouse brain cortex of each group; *P<0.05 compared with control group; E.co-expression of FcγRⅠ and NeuN in mouse brain cortex of each group; F.expression of Aβ in APP/PS1 mouse brain cortex(bar=50 nm)

表1 人脑组织样本及其捐献者具体信息Table 1 Human brain tissue samples and their donor specific information

成人和小鼠中枢神经系统神经元和星形胶质细胞也表达具有信号功能的FcγRⅠ，与IgG直接相互作用发挥神经免疫功能。发育中大鼠大脑皮层和海马神经元表达的FcγRⅠ可以影响大鼠的神经发育和功能[3]。有趣的是，有研究发现中枢神经元FcγR与脑内IgG相互作用可以导致小鼠AD样病理改变[7]。目前中枢神经元FcγRⅡb参与AD病理改变的作用机制已有相对较多的研究，FcγRⅡb已被证明有助于β淀粉样蛋白介导的神经毒性[8]，以及可介导有毒蛋白之间的病理关联[9]。

中枢神经系统中，除了神经元和星形胶质细胞，小胶质细胞也表达FcγRⅠ[10]。有研究发现，AD患者和神经退行性疾病模型小鼠中的小胶质细胞及血管周围巨噬细胞上FcγRⅠ表达增加[11-12]，而经主动免疫治疗后斑块清除的AD患者小胶质细胞上FcγRⅠ的表达则会减少[13]。研究还发现，FcγR介导的小胶质细胞吞噬Aβ在AD模型小鼠中可能具有保护作用[14]。尽管小胶质细胞上的FcγRⅠ和AD的关联已有了相对较多的研究，但中枢神经元FcγRⅠ在AD疾病背景下的表达变化及其在AD发生发展机制中的作用尚未得到明确。

本研究表明，小鼠和人类中枢神经系统中，FcγRⅠ主要表达于神经元，且APP/PS1小鼠和AD患者大脑皮层中神经元FcγRⅠ的表达减少。综上所述，中枢神经系统神经元FcγRⅠ可能在AD神经病理发生发展机制中发挥重要作用。