STR分型检测技术在胎儿性染色体嵌合体检测中的应用

胡听听 胡蓉 张艳霞 袁腾龙 卢健 王继成

(广东省妇幼保健院 医学遗传中心，广东 广州 511400)

短串联重复序列(short tandem repeat，STR)为基因组中由核心序列2～7bp重数次到数十次的高度串联重复序列，由于其具有在不同人群不同个体间具有高度多态且高杂合度，并且其检测快捷简便，使其在临床遗传性疾病检测和法医学等方面具有广泛的应用[1, 2]。 性染色体嵌合为产前诊断中常见的一种染色体异常，在患者中典型表现为身体、心理、行为、学习能力、神经认知等方面的异常，生育能力低下或者不育。但是一般情况，大多数的性染色体非整倍体患者具有正常人的生活能力、寿命以及智力[3]。在产前诊断中，STR检测技术已经广泛应用于13、18、21和XY性染色体非整倍体的检测，但对于性染色体嵌合的检测报道不多。常规的染色体核型分析检测技术为胎儿性染色体嵌合检测的金标准，但该方法费时费力，给产前遗传咨询带来难度[4]。本文回顾性分析1164例胎儿染色体检测病例，探讨STR在胎儿性染色体嵌合体检测中的作用，并报道分析如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2018年1月至2020年5月在广东省妇幼保健院(本院)进行产前诊断，筛选出性染色体异常的病例共计1164例，其中性染色体嵌合的病例有34例，年龄为18～47岁，平均年龄为28.09岁，孕周为13～30周，平均孕周为21.3。其中羊水25例(73.5%)，脐血5例(14.7%)，绒毛4例(11.8%)。本研究经我院伦理委员会批准通过，并且所有研究对象都签署了知情同意书(广东省妇幼保健院医伦第[202101243]号)。

1.2 检测方法

1.2.1 样品采集 在充分告知患者本实验情况下，进行签订知情同意书，对于羊水穿刺须在超声引导下进行羊水穿刺，穿刺过程中应尽量避开胎盘和隔膜，初始的2ml羊水丢弃后再抽取20ml羊水；对于绒毛穿刺须在超声引导下选择合适的穿刺点和角度进行，将引导套针穿刺入胎盘绒毛边缘，并使用活检针抽取绒毛组织5～10支；对于脐血穿刺应尽量避开胎盘和隔膜抽取胎儿2～4ml脐血。

1.2.2 STR检测 使用德国Macherey-Nagel公司的NucleoSpin Blood提取试剂盒进行羊水、绒毛、脐血DNA提取。定量荧光聚合酶链反应(quantitative fluorescence polymerase chain reaction，QF-PCR)扩增位点选择XY染色体上的8个STR位点，分别为AMEL、DXS1187、DX981、DXS7423、SRY、DYS448、DXYS267、DXYS218、TAF9。扩增体系为12.5μl Takara-Premix，7.5μl引物混合液，3～5μlDNA模板(约60ngDNA)。PCR反应为：95℃ 5min变性，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min循环30次，72℃ 10min后保存。PCR产物使用3500XL毛细管电泳仪检测，结果使用GeneMarkerV2分析。

1.2.3 染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis，CMA) 该实验DNA提取试剂盒为德国QIAGEN公司QIAamp DNA Blood Mini Kit提取试剂盒，芯片平台为美国Affymatrix的cyto750K芯片检测平台，实验数据分析结合公共数据库进行联合分析。

1.2.4 STR检测结果性染色体嵌合判断标准 使用GeneScan3.7软件进行结果分析，根据显示的峰图进行结果判断。判断标准(临床生化协会/临床分子遗传协会规定)如下：若STR等位基因出现3个峰，且峰值面积(area rate，AR)接近1∶1∶1，可判断为三体；若显示2个峰，则计算峰图面积，面积比值>1.8或者<0.65则判断为三体，双峰面积比值为0.8～1.4则判断为正常；介于两个区间之间的值则需重新检测，若重新检测依然介于两区之间则怀疑为嵌合，需进一步进行检测。若X染色体STR位点检测图谱钧呈现单峰，则判断为45，X。

2 结果

2.1 34例样本中绒毛4例，脐血5例，羊水25例，最小孕周13+，最大孕周35+。34例样本中，产前超声异常的有10例(29.41%)，唐氏筛查高风险或临界风险的有6例(17.65%)，无创性染色体数目异常的有12例(35.29%)，高龄的8例(23.4%)，复发性流产的2例(5.88%)，不良孕产史2例(5.88%)。(详细结果见附表1)。

2.2 34例STR性染色体嵌合体结果与CMA结果比对后，均为嵌合的为25例(73.53%)，性染色体异常的样本有7例(20.59%)，CMA正常而STR异常的样本有2例(5.88%)。25例嵌合体样本中，检测结果为45,X/46,XXY有10例(29.41%)，45,X/46,XY有6例(17.65%)，46,XX/47,XXX有3例(8.82%)，46,XY/47,XYY有2例(5.88%)，1例45,X/46,XX/47,XXX(2.94%)，1例Y染色体嵌合缺失(2.94%)，2例X染色体嵌合缺失合并重复(5.88%)。STR检测嵌合体中，CMA检测为性染色体异常的有7例，分别为47,XXY有4例(11.76%)，1例45,X(2.94%)，1例47,XXXY(2.94%)，1例Y染色体异常(2.94%)。CMA检测为阴性而STR检测提示为嵌合的有2例，检测结果分别为XY和XX。详细结果见表1。

表1 35例样本STR和CMA检测结果

续表

3 讨论

产前诊断中具有严重表型的主要染色体疾病为13、18、21-三体综合征，大约占89%[5]，随着技术的发展，为了缓解孕妇的紧张情绪和拥有更多选择时间，需要一种快速而准确的方法应用到产前诊断。QF-PCR(quantitative fluorescence polymerase，QF-PCR)的出现缓解了临床需求，现今广泛应用于临床检测13、18、21和性染色体非整倍体[6]。但是对于性染色体嵌合的诊断由于缺少准确、便捷的方法导致检出率不高。

性染色体嵌合由于往往不影响患者生存，往往在临床中被忽视，导致在人群中发生率较高，有研究发现X染色体嵌合在女性人群中发生率大概是常染色体的4倍(0～0.25%)[7]。本实验中STR检测技术和CMA检测技术均为嵌合的有25例，阳性预测值PPV为73.53%(25/34)，Dorte等[8]的研究表明QF-PCR检测非整倍体具有快速、可靠性高，但对于性染色体嵌合其阳性预测值为44%。Lildballe等[8]的研究研究与本研究的阳性预测值有差异，但该研究性染色体嵌合样本只有9例，而本研究样本更为丰富，具有更强的说服力。有2例STR检测为嵌合而CMA检测为正常，可能是STR位点的引物区的多态性而出现等位基因全部或部分丢失[9]。由于STR检测技术只选取染色体特定部分STR位点，而无法检测到性染色体其他部分缺失或重复[1]，CMA技术主要功能是检测微缺失或微重复[10]。STR检测技术在检测染色体嵌合或其他异常中具有较高的可靠性，这可能与STR检测技术通过设计染色体上多个不同的STR特异性位点而检测染色体数目异常，又通过PCR扩增，更进一步扩大了染色体异常比例。同时STR检测技术也存在诸多缺陷，比如无法检测染色体平衡易位、无法检测出少于30%母体污染的样本等。

4 结论

综上所述，性染色体嵌合的患者在精神、身体、行为、生育等方面会收到较大影响，并且随着嵌合比例的增加，其症状会加重，给家庭带来沉重负担，而使用STR检测技术能够及时而准确的获取检测结果，可以给孕妇带来宝贵的时间进行选择，极大地缓解孕妇的精神压力，对后续的产前检查也可以做出重要指导。但STR技术的本身技术缺陷使其需要联合其他方法(核型分析技术、CMA检测技术等)综合判断，给孕妇提供更准确可靠的结果[11]。故STR检测方法在产前诊断胎儿性染色体嵌合体中具有重要价值。