白藜芦醇、绿原酸对新疆驴精液低温保存效果的影响

2022-05-16王艳萍郭旭川张文倩朱春灏曾维斌

中国畜牧杂志 2022年5期

王璐，张强，王艳萍，郭旭川，张文倩，朱春灏，曾维斌

（石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000）

新疆驴作为小型驴品种，其性情温顺、耐粗饲、抗病性好，深受牧区群众喜爱，曾在农耕和运输方面发挥重要作用。目前，新疆驴主要分布在新疆南疆地区，已被列入国家畜禽遗传资源保护目录。在精液保存处理过程中，精液的离心、降温、代谢、复温等过程都会给精子造成氧化应激损伤，降低精子活力，破坏膜功能完整性，影响活性氧（ROS）的代谢平衡，扰乱细胞正常的生理生化水平，降低母畜受胎率，因此需要补充抗氧化剂来保护精子。

白藜芦醇、绿原酸作为普遍存在于植物中的天然多酚类物质，具有抗氧化、抗菌消炎等多重功能。目前的研究表明，白藜芦醇、绿原酸对提高家畜精子质量效果显著。马精液冷冻保存前添加白藜芦醇可以改善精液质量，降低DNA 损伤；白藜芦醇可以减少氧化应激，提高水牛精液的体外受精能力；15℃保存公猪精液时添加不同浓度绿原酸均能够改善精液质量；何涛等研究表明，添加50 μg/mL 的绿原酸对公猪精液的冷冻保护效果最好。添加适宜的抗氧化剂对精液的保存是有益的，但在驴精液保存时使用抗氧化剂的研究较少，可以有效改善驴精液低温保存效果的抗氧化剂浓度需要进一步检验。本实验旨在探究在自配稀释液基础上分别添加不同浓度的白藜芦醇、绿原酸对新疆驴精液低温保存效果的影响，最终获得白藜芦醇、绿原酸在新疆驴精液低温保存时的适宜添加量，为提高种公驴精液利用率、加强品种保护提供一定参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、柠檬酸钠、柠檬酸钾、葡萄糖、果糖、乳糖均为分析纯级别；白藜芦醇、绿原酸：纯度≥98%，购自北京索莱宝科技有限公司。超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.1.2 主要仪器恒温水浴锅（PK-80 上海精宏试验设备有限公司，中国），纯水仪（Direct-Q8UV-R Merck，德国），蒸汽灭菌锅（HVE-50 HIRAYAMA，日本），电子分析天平（ME204 METTLER TOLEDO，瑞士），冰箱（BCD-272AY 容声，中国），全波长酶标仪（1510 Thermo，美国），荧光倒置显微镜（DMI8 Leica，德国），恒温台（E5CC OMRON，日本）。

1.1.3 实验动物 3 头优秀新疆驴种公驴由石河子市九昌驴业有限公司提供，年龄为3～5 岁，体况良好，无生殖系统疾病，按照种公驴培育管理技术规程进行饲养。

1.2 稀释液的配置自配稀释液：准确称取HEPES 0.953 g、柠檬酸钠 0.825 g、柠檬酸钾 0.128 g、葡萄糖 2.9 g、乳糖 2.9 g、溶于100 mL 双蒸水，滤纸过滤，高压灭菌10 min，冷却至室温备用。新鲜鸡蛋敲开外壳，无菌滤纸滚动去除卵黄表面的蛋清，注射器针头轻轻挑破卵黄，无针头注射器缓慢吸取卵黄液，按照8%的比例注入冷却后的溶液中，最后加入青链霉素各10 万IU，磁力搅拌器搅拌30 min。

在自配稀释液基础上分别添加白藜芦醇（0、25、50、100、200 μmol/L）、绿原酸（0、0.03、0.06、0.09、0.12 g/L），混匀，所有稀释液均为现配现用。

1.3 精液的采集与处理发情母驴作为台畜并保定，清洁公母驴生殖器官，以温和的生理盐水冲洗并擦净。采精员站立在台畜右方，待公驴阴茎充分勃起并爬跨时，采精者顺势将阴茎托入事先准备好的假阴道，公驴完成射精动作后，打开气阀，阴茎疲软顺势抽出，对采集的精液色泽、气味、精液量等进行评价，使用品质较好的精液进行实验。

采集的精液经4～6 层纱布过滤后，按照1:1 体积比以37℃预热的自配稀释液缓慢稀释精液，室温平衡30 min后，1 800 r/min 离心10 min，弃上清，加入含有抗氧化剂的稀释液，等温稀释至原精液的3 倍。将装有精液的离心管以10 层纱布包裹，置于5℃冰箱保存，间隔12 h 翻动一次离心管，以免精子沉积。

1.4 检测指标及方法根据试验设计，在低温保存的各时间点取样，检测各组精子质量。

第4、5、6、7 天分别检测精子活率、质膜完整性及顶体完整性，第1、3、5、7 天检测SOD 活性。

1.4.1 精子活率取适量待检精液于1.5mL 离心管，37℃水浴5min，使用显微镜随机观察5 个视野下精子的运动状态，每次计数不少于200 个精子，重复3 次，观察精子活率并记录。

1.4.2 质膜完整性取1 mL HOST 液（果糖0.9 g，柠檬酸钠0.49 g，双蒸水100 mL，现用现配），37℃预热5 min，加入100 μL 精液，轻轻混匀，37℃水浴45 min。倒置显微镜下观察精子形态，转换视野记录至少200 个精子，重复3 次。质膜完整的精子由于质膜膨胀而使尾部弯曲、形成环状，膜功能不完整的精子则不发生弯尾现象。统计所含的弯尾、环状精子数所占比例。

质膜完整性=质膜完整精子数/精子总数×100%

1.4.3 顶体完整性取待测精液20 μL，制成抹片，经固定后，用过滤的吉姆萨染液（母液：PBS 缓冲液=1:9，现用现配）染片80 min，水洗风干后镜检。顶体分为4 种类型，I 型：顶体完整，边缘光滑，着色均匀，有时可见清晰的赤道板；II 型：顶体轻微膨胀，顶体膜膨大；III 型：顶体严重膨胀，着色淡，顶体边缘不整齐；IV 型：顶体完全脱落。II、III、IV 型为顶体不完整精子，随机观察5 个视野，每次计数不少于200 个精子，重复3 次，计算I 型精子所占比例。

顶体完整性=顶体完整精子数/精子总数×100%

1.4.4 SOD 活性使用超氧化物歧化酶测定试剂盒（A001-3）测定SOD 活性，按照试剂盒说明书配置检测液，正式测定前，挑取2 例正常样本稀释成不同浓度进行预实验，选取抑制率在40%～60% 的样本浓度，按说明书将检测液与样本加至96 孔板，37℃孵育20 min，450 nm 处酶标仪读数。

1.5 统计分析采用SPSS19.0 软件对数据进行单因素方差分析，结果以平均值± 标准差表示，＜0.05 表示差异显著，＞0.05 表示差异不显著。

2 结果

2.1 白藜芦醇对精液低温保存效果的影响

2.1.1 白藜芦醇对精子活率、质膜完整性、顶体完整性的影响由表1 可知，随着保存时间的延长，各组的精子活率、质膜完整性和顶体完整性均表现下降趋势。第5～7天，100 μmol/L 白藜芦醇组的精子活率显著高于其他组。保存第4、6 天，各组间的质膜完整性差异不显著；第7天时，100 μmol/L 白藜芦醇组的质膜完整性显著高于0、25 μmol/L 白藜芦醇组。低温保存第4～7 天，100 μmol/L白藜芦醇组的顶体完整性均显著高于0 μmol/L 组。

表1 白藜芦醇对精子活率、质膜完整性、顶体完整性的影响

2.1.2 白藜芦醇对低温保存精液SOD 活性的影响由图1 可知，在第3、5、7 天，各组的SOD 活性随着保存时间的延长呈下降趋势。保存第1 天时，添加白藜芦醇试验组的SOD 活性均显著低于0 μmol/L 组，100、200 μmol/L 组SOD 活性显著高于25、50 μmol/L 组。保存第3 天时，添加组SOD 活性均显著高于0 μmol/L 组，各添加组间无显著差异。保存第5、7 天时，100 μmol/L组SOD 活性均为最高。

图1 白藜芦醇对低温保存精液SOD 活性的影响

2.2 绿原酸对精液低温保存效果的影响

2.2.1 绿原酸对精子活率、质膜完整性、顶体完整性的影响由表2 可知，随着保存时间的延长，各组的精子活率、质膜完整性和顶体完整性均表现下降趋势。保存第6 天时，0.06 g/L 绿原酸组的精子活率显著高于0、0.03、0.12 g/L 绿原酸组；第7 天时，0.06 g/L 组的精子活率显著高于其他试验组。保存第4、5 天，各组间的质膜完整性差异不显著；保存第7 天时，0.06 g/L 绿原酸组的质膜完整性显著高于0、0.09、0.12 g/L 绿原酸组。保存第4、5 天，各组间的顶体完整性差异不显著；第6、7 天时，0.06 g/L 绿原酸组的顶体完整性显著高于0 g/L 绿原酸组。

表2 绿原酸对精子活率、质膜完整性、顶体完整性的影响

2.2.2 绿原酸对低温保存精液SOD 活性的影响由图2可知，各组精液中的SOD 活性随着时间延长不断变化，在第7 天时明显下降。精液保存第1 天，0.09 g/L 绿原酸组的SOD 活性显著高于其他组，0.03、0.06、0.12 g/L绿原酸组显著低于0 g/L 绿原酸组。第3 天时，0.06 g/L绿原酸组的SOD 活性显著高于其他试验组。在第5 天，0.03、0.06、0.09、0.12 g/L 绿原酸组SOD 活性均显著高于0 g/L 绿原酸组，0.09、0.12 g/L 组SOD 活性无显著差异。第7 天时，0.06 g/L 绿原酸组的SOD 活性显著高于其他试验组。

图2 绿原酸对低温保存精液SOD 活性的影响

3 讨论

3.1 白藜芦醇、绿原酸对精子活率、质膜完整率和顶体完整率的影响精液在长时间的低温保存中，会积累一定的活性氧。过量的活性氧会对精子结构造成伤害，从而降低精子活率、破坏膜功能。而完整的质膜是精子能够正常运动的基础，检测顶体完整性则是判断精子授精能力的重要方法。因此，许多研究者通过在精液稀释液中尝试添加一些具有抗氧化功能的物质来提高精液保存质量。

冷冻保存时，白藜芦醇对马精子质膜的结构与功能具有显著的保护作用，白藜芦醇也可以改善山羊冻精质量，本研究在驴精液低温稀释液中添加白藜芦醇，同样能到达提升精液保存质量的效果。在猪常温保存的精液中，添加50 μmol/L 白藜芦醇后精子活力、质膜完整率、顶体完整率和线粒体活性均较好，而添加高浓度白藜芦醇反而降低了精液品质，对精子表现出了一定的毒副作用，但本研究结果表明，尽管在添加200 μmol/L高浓度的白藜芦醇时，精液质量低于100 μmol/L 白藜芦醇组，但其精液质量仍然高于未添加组，造成这一差异的原因可能是不同动物精子受白藜芦醇的影响程度不同。

在猪精液稀释液中添加0.06～0.08 g/L 绿原酸的精子活率和质膜完整性最佳，且显著高于未添加组，本研究同样发现在驴精液低温稀释液中添加0.06 g/L 绿原酸，其保存的效果最好。绿原酸能够调控氧化还原电位，进而影响整个细胞代谢，而不恰当的绿原酸浓度会打破这种生理平衡，从而影响精子运动。本研究同样发现，第7 天时，0.12 g/L 绿原酸组精液质量明显低于0.06 g/L 绿原酸组，且与0 g/L 绿原酸组相比精液质量相差不大，说明高浓度的绿原酸削弱了其对精液质量的改善作用，对精子可能有一定的毒害作用。

3.2 白藜芦醇、绿原酸对精液SOD 活性的影响在精子的抗氧化系统中，SOD 是清除ROS 的首要物质，SOD 活性在一定程度上反映精液的抗氧化能力水平。精液中添加适宜的抗氧化剂能够改善SOD 活性，维持正常的精子功能。本研究结果表明，驴精液低温稀释液中添加白藜芦醇，保存第5、7 天时，100 μmol/L 白藜芦醇组SOD 活性均高于其他组，这与该浓度下精子活率、质膜完整性、顶体完整性最高的结果一致。在保存第1、3、5 天，添加绿原酸组的SOD 活性表现出一定波动，但第7 天时SOD 活性明显下降，这表明在保存早期绿原酸可能对维持精液SOD 活性的效果更好。

植物多酚发挥抗氧化功能的途径多样，不仅能够通过激活Nrf2/ARE 信号通路进行，调控下游抗氧化基因的表达及SOD、CAT、GSH-Px 等酶的合成水平，还可以通过提高抗氧化酶活性、增加非酶抗氧化物含量来完成。另外抗氧化剂可以和周围的氧结合发生还原反应，降低精液中的氧含量，与氧化过程的中间产物结合吸附自由基、阻止链式反应，阻断氧化反应。研究证实，白藜芦醇对ROS 的生成具有一定的抑制作用，可通过亲电反应元件激活Nrf2 或直接中和ROS 来调节细胞的氧化还原反应。绿原酸含有活性羟基与羧基，不仅可以通过提供氢自由基来有效消除活性氧和羟基自由基，降低对精子的氧化损伤，保持精子结构、功能完整性，也能够通过谷胱甘肽等途径上调抗氧化酶活性。晁娅梅等研究表明，茶多酚添加到猪日粮中，肝脏的GSH-Px 活性及总抗氧化能力提高，但等基因表达降低。本试验中，分别添加不同剂量的白藜芦醇、绿原酸后，在精液低温保存第1 天，与不添加抗氧化剂组相比，稀释液中添加抗氧化剂均会不同程度地降低SOD 活性，说明在添加抗氧化剂的早期，抗氧化作用可能主要通过影响SOD 活性以外的方式进行，因此对抗氧化剂在精液低温保存时的抗氧化能力需要更为系统的研究。