长链非编码RNA 在畜禽脂代谢中的作用研究进展

孙嘉宏，谭晓冬，杨欣婷，赵桂苹，文 杰，刘冉冉

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，农业农村部动物遗传育种与繁殖（家禽）重点实验室，北京 100193）

脂肪是动物重要的储能与供能组织，当动物能量过剩时，脂肪以中性脂质的形式储存在体内；当能量缺乏时，脂肪则通过脂解的方式为机体提供能量。畜禽许多重要经济性状与脂代谢密切相关，如背膘厚、肌内脂肪含量和腹脂率等。以肉鸡生产为例，肌内脂肪含量提高有利于肉品质提高，而腹部脂肪过度沉积会影响胴体品质和经济效益，并造成环境污染。因此，研究机体脂代谢的精准调控机制将为体脂性状的遗传技术研发奠定必要基础。

长链非编码RNA（Long noncoding RNAs，lncRNA）是一类长度大于200nt、不编码蛋白质的RNA，广泛存在于动植物中。在很长一段时间内，lncRNA 被看作是“转录噪声”，不被人们重视。但近些年研究已充分证明，lncRNA 在生物体代谢调控过程中发挥着重要作用，如lncRNA 在肌细胞分化和细胞周期过程中具有调控作用，并直接参与卵子成熟、精子形成、胎盘形成、妊娠、性腺激素应答、胚胎发育等过程。lncRNA 在脂肪代谢中同样起重要调控作用，lncRNA 与棕色脂肪生成、白色脂肪生成、血浆高密度脂蛋白浓度、血浆甘油三酯浓度有关。lncRNA 在小鼠和人上的相关研究较为丰富，在肝脏中，LNCLSR 直接与TDP-43 结合并抑制的表达以下调甘油三酯水平，APOA1-AS 在体内外均对的表达有负调控作用，以抑制高密度脂蛋白形成，在脂肪发育过程中，SRA 通过调节PPAR和P38/JNK 磷酸化促进体外脂肪生成，促进前脂肪细胞分化，ADINR 通过转录激活C/EBPa 促进脂肪生成，Blnc1 结合转录因子EBF2 促进棕色和米色脂肪细胞分化。在畜禽脂代谢研究中，lncRNA 调控机制解析也成为研究热点之一。因此，本文就lncRNA 及其在畜禽脂代谢上的相关研究进展做一综述，为相关工作提供科学依据。

1 lncRNA 简介

lncRNA 的种类繁多，功能复杂，在不同的物种间保守性较低，有组织和发育阶段特异性，在不同的亚细胞区域发挥作用。由于lncRNA 结构和功能的多样性，为利于开展研究，通常根据lncRNA 与功能基因的相对位置对其进行分类。根据其与邻近蛋白质编码基因的相对位置可将lncRNA 分为六类，包括：①基因内lncRNA：来源于内含子的二次转录；②基因间lncRNA：位于2 个基因的间隔区域内，构成最大的非编码RNA 家族；③正义lncRNA：由蛋白质基因编码的正义链转录；④反义lncRNA：由蛋白质基因编码的反义链转录，大约70%的lncRNA 是自然反义转录本（Natural Antisense Transcripts，NAT）；⑤双向lncRNA：由蛋白质编码基因的反向互补链转录，其功能与蛋白质编码基因相似；⑥增强子lncRNA：通过向特定的基因启动子募集染色质重塑复合物来增强基因活性。

已知的lncRNA 实现生物学功能的分子机制包括（图1）：①lncRNA 作为信号分子，对来自细胞内或细胞外的各种刺激做出回应，作为特定时间、地点、生理状态、基因调控的标志物；②lncRNA 作为诱饵分子，诱导某些蛋白质、RNA 或MicroRNA（miRNA）分子离开特定的区域；③lncRNA 作为引导分子，通过与目标分子结合，指引核糖核蛋白复合体定位至目标区域，进而影响邻近基因或远距离基因的表达；④lncRNA 作为支架分子，为多个不同类型大分子组件的装配提供一个中心平台，在生物信号传导过程中发挥调控作用。

图1 lncRNA 实现生物学功能的分子机制[22]

lncRNA 能够在染色质、转录和转录后等水平影响基因表达，从而发挥生物学功能（图2）：①染色质水平：通过介导染色质重构以及组蛋白修饰来调控下游基因的表达，lncRNA HOTAIR等可以将核心蛋白复合体招募到特定位点，在那里将组蛋白H3 的赖氨酸27 残基3（me3K27）甲基化以诱导异染色质的形成和抑制基因表达（图2-a）；②转录水平：与上游启动子区结合，干扰下游基因的表达。lncRNA 募集RNA 结合蛋白TLS（translocatedinliposarcoma）来调节CREB 结合蛋白（CBP）和p300 的组蛋白乙酰转移酶活性，以抑制基因转录（图2-b）；一种超保守的增强子被转录为一个lncRNA，Evf2 作为转录因子DLΧ2 的共同激活因子可调节Dlx6 基因的转录（图2-c）；lncRNA可以在主要启动子处形成一个三联体以阻断一般转录因子TFIID 的结合，从而使基因表达沉默[26]（图2-d）；③转录后修饰：反义lncRNA 通过与mRNA 形成互补双链，干扰mRNA 的剪切或者生成内源性Small interfering RNA（siRNA）来调控基因的表达（图2-e）。

图2 lncRNA 的功能[29]

2 lncRNA 在畜禽脂代谢中的研究进展

2.1 lncRNA 在肝脂代谢过程中的作用 肝脏在脂肪的消化、吸收、分解、合成及运输等代谢过程中发挥重要作用，是机体脂代谢的枢纽。肝脏从血液中摄取游离脂肪酸，合成甘油三酯，随后以极低密度脂蛋白的形式将甘油三酯转运出肝。正常情况下，肝脏仅储存少量脂肪酸，当机体营养过剩时，肝脂代谢加剧会引起代谢性综合征。大量研究表明，畜禽肝脂代谢受表观遗传调控，包括lncRNA 作用。

对家禽而言，由于脂肪细胞不能或仅能合成微量脂类，肝脏成为其内源性脂类合成的主要部位。Tan 等利用实验室前期建立的持续5 个世代的鸡脂肪肝父系遗传模型为素材，通过对肝脏进行DNA 甲基化和lncRNA 测序研究脂肪肝发生后肝脏表观修饰的变化，发现易感系公鸡83 个脂肪和葡萄糖相关基因中有72%上调；通过共表达网络分析鉴定到与脂代谢相关的重要新lncRNA（LNC_006756、LNC_012355 等）；此外，脂肪肝发生后肝脏甲基化水平显著降低，并发现23 个甲基化与lncRNA 的共同靶点基因（等）。Li 等通过转录组测序比较20 周龄和30 周龄预产蛋鸡和产蛋高峰鸡的肝脏中lncRNA 表达差异，鉴定了一系列与鸡肝脂代谢相关的lncRNA，分析了产前和产蛋母鸡之间在肝脏中存在显著差异表达的lncRNA 即lncLTR 的表达调控方式，lncLTR 受雌激素通过ERbeta 信号调节，并与鸡胴体性状和血液甘油三酯含量有关。基因组功能注释是弥合基因型和表型之间差距的关键，Muret 等通过RNA-Seq 对鸡肝脏和脂肪组织中lncRNA 转录组进行分析，在鸡肝脏和脂肪组织中提供了一个完整的lncRNA 库，该库显示了mRNA 和lncRNA 之间共表达的有趣模式，很多在其他物种上验证的lncRNA 在鸡上不具有参考意义，在肝脏和脂肪沉积中，相较于mRNA，lncRNA 表达量更低、组织特异性更强，他们还强调了参与脂质代谢的新型lncRNA 候选物lnc_DHCR24，它与编码胆固醇生物合成关键酶的基因表达量高度相关。Ning 等在构建了4 个发育阶段（60、133、220、400 日龄）肝脏组织的12 个RNA 文库，鉴定的lncRNA 中一半以上是lincRNA（long intergenic ncRNAs），功能富集与脂质代谢有关，通过结合加权基因共表达网络分析（WGCNA）构建DE-lncRNA（Differentially expressed lncRNA）和DEG（Differentially expressed gene）之间的共表达网络，功能富集结果也与脂质代谢有关，表明DE-lncRNA 具有调节肝脏脂质代谢的生物学功能。

Liang 等使用HiSeq 平台对3 只荷斯坦奶 牛在干乳期、泌乳早期和泌乳高峰期的9 份肝脏样品的cDNA 和sRNA 文库进行了测序，构建了一个大型的可能影响牛乳脂合成的内源竞争RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA）调控网络，找到12 个可能会通过胰岛素、PI3K-Akt、MAPK、AMPK、mTOR和PPAR 信号传导途径影响肝脏脂质代谢的候选基因。

综上，由于物种间差异，已验证的lncRNA 对其他物种参考意义有限，研究者们仍致力于构建肝脏组织lncRNA 和mRNA 共表达网络以及筛选出有参考价值的lncRNA。

2.2 lncRNA 在脂肪沉积中的作用 动物体内脂肪沉积程度取决于血浆中甘油三酯水平，脂肪沉积与畜禽繁殖、生长、产肉性状有关，且脂肪对肉品质及其加工特性有重要影响。机体内脂肪沉积主要取决于合成代谢和分解代谢之间的动态平衡，lncRNA 对畜禽脂肪沉积有着重要作用。

Chen 等使用来自白色杜洛克和二花脸杂交的两个F全同胞雌性个体240 日龄的肝脏、腹脂和背最长肌的数据以鉴定581 个与猪肌肉生长和脂肪沉积相关的lincRNAs，从预测的lincRNAs 中筛选了一些靶基因，与肌肉生长有关，和与脂肪沉积有关，和与肌肉生长和脂肪沉积均有关。这些lincRNAs 可能通过靶基因的稳态调节参与猪肌肉生长或脂肪沉积有关的生物学过程。lncRNA 虽然有组织特异性，但仍可能同时参与不同的生物学过程。脂肪沉积研究中可以将lncRNA 和性激素研究结合，Wang 等对阉割和未阉割的全同胞淮南公猪皮下脂肪组织进行转录组分析，共鉴定出343 个lncRNAs，其中18 个lncRNAs 在2 个组中差异表达，功能分析表明这18 种lncRNAs 及其靶基因参与脂肪酸、胰岛素和脂肪细胞因子信号通路，去势猪的脂肪酸合成和代谢更为活跃。Li 等在鸡上也发现lncLTR受雌激素调节。Zhang 等对嘉兴黑猪和长白猪皮下脂肪的lncRNAs 和mRNAs 表达谱进行比较，鉴定到221 个lncRNAs 和958 个mRNAs，对DEG 进行功能分析，其主要参与免疫应答、PI3K-Akt 信号通路和MARK 信号通路等与脂肪形成和脂质代谢相关通路，其中LTCONS_00055593 可能通过调节其靶基因在脂肪代谢和沉积中起关键作用。

羊的“脂尾”可以在迁徙期间和牧场处于休眠状态或干物质较少的季节为机体提供能量。绵羊的尾脂是人类用作膳食脂肪的重要来源。为鉴定与尾脂沉积和发育相关的lncRNA 和mRNA，Ma 等对兰州肥尾羊、小尾寒羊和藏羊的尾脂进行高通量测序，对筛选的mRNA-lncRNA 对构建共表达网络，发现4个lncRNA（TCONS_00372767、TCONS_00171926、TCONS_00054953 和TCONS_00373007）与超过50 个mRNA 相互作用，对其靶基因进行功能富集可发现这些基因广泛参与脂肪酸代谢和脂肪酸延伸相关途径，均有助于脂肪沉积，可能作为核心lncRNA 在尾部脂肪沉积过程中发挥关键作用，并且mRNA 和lncRNA 可能主要通过正调控发挥作用；组学分析说明mRNA 和lncRNA 在脂代谢中可能通过同向表达发挥作用。

肉鸡的生长速度通过遗传选择可实现持续性提高，但对快速生长的选择会伴随腹脂过量，会影响饲料转化率，降低腹脂沉积已成为肉鸡育种目标之一。Zhang 等以14 日龄京海黄鸡腹部脂肪组织的前脂肪细胞为样本，通过对不同分化阶段的转录组进行测序，鉴定出1 336个lncRNA 和1 759 个mRNA 差异表达，且在分化过程中各个阶段差异表达基因数下降，这些基因涉及与前脂肪细胞分化相关途径，包括丙酸脂代谢、脂肪酸代谢、氧化磷酸化途径等。杜志强等指出lncRNA 基因可抑制活化T 细胞核因子（），且和在东北农业大学肉鸡腹脂双向选择系和爱拔益加肉鸡群体腹部脂肪组织中的表达水平随周龄增加而显著升高，提示基因可能影响肉鸡肌肉和脂肪组织生长发育。李富原等研究发现随填饲时间的增加，lncRNA LOC106047490 在朗德鹅肝脏、腹脂和胸肌中的表达量明显下降，该基因受高葡萄糖、胰岛素和不饱和脂肪酸的诱导且该基因在成年鹅腹脂中的表达量最高，提示LOC106047490 与脂肪代谢有关。

在牛上的相关研究主要关注脂肪组织的发育及分化。刘宇利用高通量测序等技术在秦川牛成年母牛皮下脂肪组织、内脏脂肪组织和6 月龄犊牛皮下脂肪组织中分别获得了大量差异表达的lncRNA，并对犊牛皮下脂肪组织特异性表达的lncRNA TCONS_00596625进行了生物信息学分析及双荧光素酶报告系统验证，发现其存在bta-miR-125b 结合位点。有研究发现btamiR-125b 参与牛肉嫩度调节，并且在健康奶牛和患乳房炎奶牛的乳腺组织中差异表达，提示该lncRNA TCONS_00596625 可能通过与bta-miR-125b 的结合参与到上述生物学过程中。Li 等通过Ribo-Zero RNAseq 研究体外培养的牛前脂肪细胞和分化的脂肪细胞中PolyA+lncRNA 和PolyA－lncRNA，共确定了2 882 个lncRNA，其中lncRNA ADNCR 作为miR-204 的竞争性内源RNA（ceRNA），增强miR-204 靶基因的表达，通过与NCoR 和SMART 作用来抑制PPAR的活动，从而抑制脂肪细胞分化和脂肪合成基因表达。肖航等对肉牛肌肉和脂肪组织lncRNA 组学测序分析发现的lncRNA TCONS-585 进行荧光定量PCR 验证，发现其在脂肪组织中表达水平显著高于其他组织，干扰lncRNA TCONS-585 能下调具有抑食作用、参与脂肪分化的基因的表达，从而可能影响牛脂肪组织的分化。

2.3 lncRNA 在肌内脂肪沉积中的作用 肌内脂肪（Intramuscular Fat，IMF）分布在肌外膜、肌束膜、肌内膜，主要由甘油三酯、磷脂和游离脂肪酸组成。IMF 含量增加可提高肉的风味、嫩度和多汁性。IMF 沉积使肌肉组织的交织结构松散，增加肌肉嫩度；其中的磷脂可以通过美拉德反应产生香味；食物中的IMF 还可以通过刺激人类唾液分泌来增加咀嚼时的适口性。IMF 是畜禽肉品质选育的重要指标之一。

不同的脂肪组织具有不同的生化特性和肌内表达模式，为研究lncRNA 在鸡IMF 和腹脂形成中的功能，Zhang 等采用Ribo-Zero RNA-Seq 技术进行转录组分析，鉴定到1 624 个差异lncRNAs，其中lncAD 与PPAR 信号通路的多个基因共表达，且其下调会以顺式调控的方式抑制的表达，从而减少肌内前脂肪细胞的成脂分化，并促进细胞增殖。Χing 等以高IMF 肉鸡品系的胸肌和腹脂转录组数据，通过WGCNA（Weighted Correlation Network Analysis）分析对发育过程中影响胸肌、腹脂沉积的功能基因模块及其枢纽基因进行鉴定，并且筛选到了可能与胸肌IMF 沉积相关的核心lncRNA ENSGALG00000041996、ENSGALG00 000053368、LOC107050564、ENSGALG00000048510等，其中可能与胸肌早期发育阶段IMF 沉积相关的lncRNA ENSGALG00000041996，它可能通过调控与脂肪酸转运相关的和与催化线粒体脂肪酸氧化有关的发挥作用。

Abu-Elheiga 等研究发现基因敲除小鼠可以防止肥胖和高脂肪诱发的糖尿病，Zou 等推测可以促进脂质合成或沉积，并且发现皖南花猪中lincRNA TCONS_00061360 的高表达可以正向调节脂肪酸氧化途径的必需调节剂——的表达，从而促进脂质合成或沉积，在背最长肌中形成更高的IMF 含量。Huang 等对脂肪沉积差异显著的莱芜猪和大白猪之间IMF 基因表达谱进行比较分析，共鉴定出54 个lncRNAs 和482 个mRNAs，研究表明ΧLOC_046142、ΧLOC_004398 和ΧLOC_015408 可能分别靶向和，并在猪IMF 形成和脂质蓄积中起关键的调节作用。ΧLOC_064 871 和ΧLOC_011001 可能通过调节和在脂质代谢相关疾病中起作用。Sun 等对脂肪型和瘦肉型猪种各3 头仔猪的肌内前脂肪细胞分化过程分4 个阶段进行了转录组分析，鉴定出1 932 个差异lncRNAs，其中lnc_000414 与脂肪合成密切相关，该lncRNA 可作为猪IMF 细胞增殖的抑制剂。

在牛上，Wang 等构建了0.5 岁和2.5 岁2 个发育阶段背最长肌以及其肌内脂肪的整个转录组图谱差异表达概况，并且根据2 个组织中共表达的转录本构建了ceRNA 调控网络，推测3 个ceRNA 子网（miR-381-y-TCONS-00016416-SIRT1、miR-122-x-TCONS-000617 98-PRKCA、miR-499-y-TCONS-00084092-LPL）可能在IMF 沉积调节中起关键作用。

3 小结与展望

目前，lncRNA 在畜禽脂肪代谢方面的研究仍处于起步阶段，已有研究集中在挖掘新lncRNA 以及lncRNA 与miRNA 的相互作用机制。虽然已有研究解析了部分lncRNA 在脂代谢过程中的调控机制，但是由于lncRNA 具有保守性低、作用方式多样的特点，且畜禽个体间差异大，其功能解析成为研究难点。将挖掘到的lncRNA 进行功能解析和调控机制的研究，最终实现通过靶向调节lncRNA 对畜禽脂代谢进行定向调控，将是相关研究领域的重要方向之一。