晚期糖基化终末产物的测量分析

王海璇 徐顾航 王智旖

摘要：晚期糖基化终末产物（AGEs）是人体内过量糖与蛋白质结合产物。人体内AGEs有两个来源，一种体内过量糖与蛋白质在体内合成AGEs，另一种是通过食物摄入AGEs。体内过量AGEs是诱发慢性炎症的主要原因，本文就目前AGEs检测方法进行综述。

关键词：晚期糖基化终末产物;荧光检测法;免疫学检测法

晚期糖基化终末产物（AGEs）是葡萄糖或其他糖类衍生物与蛋白质或脂质通过非酶促反应产生的。AGEs促进氧化应激反应，活化多种转录因子并产生大量促炎细胞因子。AGEs包括羧甲基赖氨酸（CML）、羧乙基赖氨酸（CEL）、吡咯啉、戊糖苷和甲基乙二醛-赖氨酸二聚体（MOLD）等。目前生物样本中AGEs的检测方法主要为色谱法和免疫学法。色谱法包括HPLC/MS、GC-MS和LC-MS/MS等，免疫学法包括ELISA法和免疫印迹法。

AGEs荧光法检测法非常简单，是一种无创快速地检测皮肤内AGEs水平的方法。大量临床研究结果也证实皮肤中AGEs荧光强度与HPLC法检测所得血清总AGE浓度存在显著相关性。由于糖化血红蛋白仅能反映1个月以内短期血糖水平的异常，而皮肤内AGEs自发荧光水平已经被证明是长期糖尿病患者预测并发症发生的重要指标。不同肤色也影响着皮肤内AGEs自发荧光光水平，深色皮肤受试者AGEs测量值低于浅色皮肤者。皮肤内AGEs水平与机体氧化应激水平有关。高水平的氧化应激反应会诱发糖尿病并发症的发生，该方法适用于健康人群和患病人群日常健康监测。虽然皮肤内AGEs自发荧光水平可以监测个体的代谢健康水平，但仍存在局限性，如皮肤内还存在各种其他荧光物质（烟酰胺腺苷二核苷酸等），具有相同的激发和发射光谱范围（分别为350～410 nm和420～600 nm），会产生干扰效应，該技术在临床中使用还需要进一步完善。

现有的色谱学技术，包括质谱和气/液相色谱技术，可以精确的测定AGEs含量，但这些技术需要专业操作人员，且仪器成本也高昂。上述原因导致这些技术难以广泛使用。LC-MS/MS技术的灵敏度远高于荧光检测法，该技术可以用于分析检测样本中非挥发性化合物。其一个显著的特点是通常不需要衍生处理。GC-MS技术已经广泛用于血浆和尿液中两种AGEs，包括CML和CEL的检测分析，并可以精确定量分析食物样本中 CML含量。目前还有一种基于超高压液相色谱（UHPLC） 的新技术，可以实现更高的分辨能力和更快的分析速度。

免疫学方法具有简便快速等优势，但制备高质量的单克隆抗体是关键，但目前仍没有定量检测AGEs的标准免疫学方法。虽然ELISA法已广泛用于检测血清或其他生物样本以及食物中的AGEs含量，该方法仍存在局限性，包括现有的抗体缺乏特异性，蛋白质糖化交联物易导致高检测背景，以加热或碱液预处理样本易产生无糖化合物干扰。最新研究结果表明，人血浆或尿液以及各种食物中的CML可以代表总AGEs含量，并且ELISA法检测CML结果可靠，与LC-MS/MS法检测结果相关性显著。此外，血清中AGEs、RAGEs 和sAGEs含量也可以通过蛋白质印迹方法来测量。蛋白质印迹技术较ELISA法具有更高的灵敏度和特异性，能够检测到样品中仅0.1 ng的目的标蛋白质。尽管蛋白质印迹技术具有很高的灵敏度和特异性，但它仍可能产生不可靠的结果。例如当抗体与某种蛋白质发生交叉反应时则可能出现假阳性，当大分子量蛋白质没有足够时间完全转移至PVDF膜上时则可能会出现假阴性。此外还可能会出现条带褪色或多条带等现象，并可能影响结果的判读。总的来说，蛋白质印迹技术的完成需要专业的实验人员和实验室设备，整个过程耗时耗力，任何一个步骤的细小错误就可能会危及整个过程。蛋白质印迹技术与ELISA技术的最大区别在于，蛋白质印迹技术可以同时检测多个目标蛋白，而 ELISA法只检测一种目标蛋白，同时蛋白质印迹技术还可以分析目标蛋白的分子量。因此我们还可以通过蛋白质印迹技术分定量分析待检样本中AGEs或RAGEs的含量。

总之，检测样本中AGEs含量的最佳技术的选择取决于以下几种因素，包括训练有素的人员、可用的实验室、资金和研究对象（AGE浓度、样品数量、样品类型等）。选择合适的AGEs检测方法可以为临床诊疗提供可靠数据，而稳定可靠的检测数据可以为健康监测、糖尿病患者体内炎症反应水平和疾病严重程度评估提供可靠的实验室检测结果。

参考文献

[1] Uribarri J， Cai W， Peppa M， et al. Circulating glycotoxins and dietary advanced glycation endproducts： two links to inflammatory response， oxidative stress， and aging[J]. The Journals of Gerontology Series， 2007， 62（4）：427-433.

[2] Takeuchi M and Yamagishi S.  Involvement of toxic AGEs （TAGE） in the pathogenesis of diabetic vascular complica- tions and Alzheimer’s disease[J]. Journal of Alzheimer's Disease， 2009， 16（4）：845-858.

[3] Nagai R， Fujiwara Y， Mera K， et al. Immunochemical detection of Nε-（carbox-yethyl）lysine using a specific antibody[J]. Journal of Immunological Methods， 2008， 332（1-2）：112-120.

作者简介：王海璇（2000—），女，江苏徐州人，本科在读，研究方向（糖尿病及其并发症发病机制研究）

本论文受江苏大学大学生科研立项资助（20AD0131）