基于网络药理学和分子对接探究马齿苋治疗溃疡性结肠的作用机制

樊艺萌 ， 魏媛媛 ， 韩俊成 ， 张艳楠 ， 尕 玉 ， 郝智慧

(1.中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193 ； 2.新疆农业大学动物医学学院 ， 新疆 乌鲁木齐 830052)

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)会导致结肠与直肠发炎与溃疡[1]，其发病表现为腹痛、腹泻、体重减轻等[2]。溃疡性结肠炎在宠物临床时有发生，犬猫均可见，多由于误食坚硬且不易消化的异物所致[3]。目前，溃疡性结肠炎治疗主要采用皮质类固醇、氨基水杨酸和硫唑嘌呤等药物[4-5]，但其副作用较大，且治疗后易复发[6]。中药多成分、多靶点、多通路的作用特点在治疗复杂疾病上显示出独特的优势[7-8]，可作为目标药物治疗结肠炎。

马齿苋味甘酸，性寒，无毒，具有清热解毒、除湿止痢的功效，在临床上常用于治疗结肠炎。同时作为药食同源的天然药物，马齿苋也具有很高的开发价值。运用马齿苋胶囊加灌肠治疗对溃疡性结肠炎的有效率高达91.42%[9]。赖重波[10]的研究同样表明，马齿苋中药对产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌构建的大鼠湿热型泄泻模型具有良好的治疗效果。但由于马齿苋多成分、多靶点、多通路的作用方式，其对溃疡性结肠炎的治疗机制尚不清晰。

中药复方多成分、多靶点的理念与网络药理学不谋而合。网络药理学是由Hopkins[11]率先提出的，结合计算机软件、系统生物学等新兴技术，通过网络可视化，揭示药物—活性成分—靶点之间的关系，目前被广泛用于预测中药及复方的作用机制。徐小港等[12]利用网络药理学发现，清震汤可能通过作用于白介素6(IL-6)、趋化因子8(CXCL8)、肿瘤坏死因子(TNF)、环加氧酶2(PTGS2)等关键靶点，影响多条信号通路来治疗偏头痛。Xu等[13]利用网络药理学不仅初步阐明了元胡止痛片作用机理，还发现其具有抗焦虑、抗抑郁的新功效。

基于以上观点，本试验以马齿苋为研究对象，通过网络药理学分析，获得其活性成分与靶点的作用网络，并通过筛选得到起治疗作用的关键基因，使用分子对接验证其与活性成分的结合度，探究其治疗溃疡性结肠炎的作用机制及预测靶点的准确性，为新药的研发及后续试验提供相应的理论依据。

1 材料与方法

1.1 马齿苋活性成分及相关靶点的筛选 在中药系统药理学平台(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)中输入“马齿苋”，并设定筛选值为口服生物利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18，并在TCMSP中获取马齿苋活性成分的作用靶点，利用Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)对靶点的名称进行标准化。

1.2 马齿苋—活性成分—靶点网络图构建 将1.1中所得到的马齿苋活性成分及其靶点输入Cytoscape中，构建马齿苋的“中药—化合物—靶点”网络图。

1.3 溃疡性结肠炎靶点的获取及关键靶点的筛选 以“Ulcerative colitis”为关键词，在Genecard(https://www.Genecards.org/)、OMIM(https://www.omim.org/)、Malacards(https://www.malacards.org/pages/info/)等数据库中进行检索，得到溃疡性结肠炎的相关靶点，利用venn Bioinformatics & Evolutionary Genomics (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) 将马齿苋活性成分的靶点与溃疡性结肠炎的靶点取交集，所得到的靶点导入STRING数据库中，设置物种为“Homosapiens”，其余参数均为默认，得到靶点互作关系网络，将数据导入Cytoscape中对图像进一步优化，并利用Cytoscape中Cytohubba插件对该网络中排名前10位的基因进行筛选，得到马齿苋作用于溃疡性结肠炎的潜在靶点。

1.4 富集分析 将1.3中得到的76个靶点输入DAVID数据库中，物种选择为“Homosapiens”，进行基因本体(Gene Ontology,GO)分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析。

1.5 分子对接验证 为验证网络药理学筛选出的关键治疗靶点的准确性，采用分子对接对其进行验证，将核心活性成分Kaempferol、Quercetin、β-sitosterol与核心治疗靶点IL-1β、IL-6、血管生成因子(VEGF)分别对接，得到作用分数。在Pubchem中下载活性成分的2D结构，靶点蛋白的结构来自PDB蛋白质结构数据库，相应的PDB ID如表1所示。使用Pymol对蛋白结构进行脱水，去除其他连接分子的处理后，再通过Autodock软件对分子和靶点进行对接，运用Pymol进行分子对接结果的可视化。

表1 分子对接靶点蛋白的结构信息

2 结果

2.1 马齿苋的活性成分及靶点 从TCMSP数据库中共筛选到马齿苋的成分55个，其中活性成分有10个，如表2所示。同时找到马齿苋的靶点共118个，运用Cytoscape构建马齿苋—成分—靶点网络图，如图1所示。

表2 马齿苋治疗溃疡性结肠炎的核心成分

图1 马齿苋 “中药—化合物—靶点”网络

2.2 马齿苋治疗溃疡性结肠炎的潜在靶点及蛋白互作(PPI)网络分析 通过Genecard、OMIM、Malacard数据库进行溃疡性结肠炎的靶点筛选、去重，得到相关靶点5 143个。如图2所示，对疾病靶点和马齿苋活性成分的靶点取交集后，得到马齿苋发挥治疗作用的关键靶点76个，最后利用Cytohubba插件筛选出排名前10位的靶点，利用分子对接对IL-6、IL-1β以及VEGF进行了后续的验证。

图2 马齿苋治疗结肠炎的潜在靶点及PPI分析

2.3 富集分析 将2.2中得到的76个关键靶点导入DAVID数据库中进行马齿苋治疗溃疡性结肠炎的GO和KEGG通路的富集分析，筛选与疾病相关的前20名,结果见图3。GO分析表明，外泌体(Extracellular exosome)、细胞膜(Plasma membrane)、细胞外间隙(Extracellular space)、RNA聚合酶Ⅱ正向调控转录(Positive regulation of transcription by RNA polymerase Ⅱ)、转录的正向调控(Positive regulation of transcription,DNA-templated)和细胞增殖的正向调节(Positive regulation of cell population proliferation)等生物过程参与了马齿苋的治疗，分子功能主要涉及蛋白质同源化(Protein homodimerization activity)、同源蛋白质结合(Identical protein binding)和蛋白结合(Protein binding)等。KEGG通路富集分析显示，癌症通路(Pathway in cancer)、PI3K-Akt通路(PI3K-Akt signaling pathway)和MAPK通路(MAPK signaling pathway)等信号通路在马齿苋治疗中发挥了关键的作用。

图3 马齿苋治疗溃疡性结肠炎GO、KEGG富集分析

2.4 分子对接验证 为了验证网络药理学预测结果的准确性，选用了2.2中预测出的前3名关键靶点(IL-1β、IL-6、VEGF)及马齿苋中的活性成分(Kaempferol、Quercetin、β-sitosterol)进行分子对接。一般认为对接分数越低，对接活性越强，打分就越高。分子对接结果显示，活性成分与靶点之间都形成了氢键，提示它们具有良好的结合活性，见图4、图5。

图4 马齿苋中活性成分与关键靶点的分子对接打分热图

图5 马齿苋活性成分与关键靶点的分子对接结果

3 讨论

溃疡性结肠炎是导致机体腹泻的重要疾病，其病程进展缓慢，程度不一，可能伴随巨结肠症、眼部及关节部位的炎症和结肠癌的相关症状[14]。目前溃疡性结肠炎病因尚不明确，自体免疫性疾病、遗传学、肠道菌群及环境因素的改变都会导致溃疡性结肠炎的发生[15]。近年来，中药作为药物开发资源库，受到了越来越多人的重视，中药及其活性成分可用于抗病毒[16-17]、抗肿瘤[18]、提高机体免疫力[19]。在1990年，马齿苋被世界卫生组织(WHO)称为“全球灵丹妙药”，在治疗胃肠道疾病上发挥了独特的疗效[20]，但是其治疗机制尚未被揭示。在本试验中，网络药理学与分子对接技术相结合，构建出了马齿苋治疗溃疡性结肠炎的网络图，并对网络药理学预测出的活性成分及关键靶点进行验证，初步阐明了马齿苋治疗溃疡性结肠炎的潜在作用机制。

依托TCMSP数据库，根据OB、DL值筛选共得到包括山萘酚、槲皮素、β-谷甾醇在内的10个活性成分，结合PPI作用网络及Ctyohubba插件的应用发现IL-1β、IL-6、VEGF等靶点在治疗中发挥着重要的作用。马齿苋的活性成分之一山萘酚，是一种黄酮类化合物，广泛存在于各种蔬菜和水果中[21-22]，大量研究表明其具有抗炎和抗氧化的活性[23]。槲皮素、β-谷甾醇均被证明具有良好的抗炎活性[24-25]。IL-1β、IL-6是炎性反应中的重要调节因子。卞艺斐[26]的研究表明，马齿苋的水提液可以通过降低IL-1β、IL-6等炎症因子的表达，减轻结肠炎。VEGF在组织缺血时，表达会上升并促进上皮细胞增殖，因此在缺血性结肠炎中具有关键的作用[27]。以上研究表明，马齿苋的主要活性成分山萘酚、槲皮素以及β-谷甾醇极有可能是通过降低炎症的发生以及促进血管新生在治疗结肠炎中发挥作用。

KEGG通路涉及了癌症通路、PI3K-Akt通路及MAPK通路，溃疡性结肠炎在发病过程中如果不及时加以治疗极有可能发展为结肠癌，而网络药理学结果预测得到马齿苋的治疗靶点较多都富集在癌症通路中，说明马齿苋可能通过抑制癌症通路，预防结肠癌的发生。PI3K-Akt以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)均在炎症反应中发挥重要作用[28-29]，再次印证了马齿苋通过抑制炎症的发生进而缓解溃疡性结肠炎。分子对接发现马齿苋的活性成分均与靶蛋白具有良好的对接分数，表明了活性成分与靶点之间可以稳定结合，发挥治疗结肠炎的作用。

综上，本试验以马齿苋作为研究对象，通过网络药理学方法初步揭示了马齿苋通过多活性成分作用于多靶点及多条通路对溃疡性结肠炎起到了治疗作用，为后续产品的研发提供了相应的参考，同时也为马齿苋的进一步开发提供了思路。