过表达花生ABA途径抗逆基因AhLOS5提高转基因烟草的耐盐性研究

武晓亮，焦娟，张连，张利民，张艳艳，赵瑞仝，李文金

（泰安市农业科学院，山东 泰安 271000）

目前我国土壤次生盐渍化现象日趋严重，盐碱地总面积3600万hm2，其中盐碱耕地920万hm2［1］。选育耐盐作物品种能够有效开发并利用盐碱地，提高资源利用率。

花生（Arachis hypogaeaL.）是我国单产、总产和出口创汇额最高的油料作物，对保障我国食用油供给安全、改善和提高我国城乡居民营养水平具有重要意义。花生属中等耐盐作物，以其扎根深、能够充分利用所吸收的少量水分、适应性强成为适应盐碱旱薄地的优势农作物［2］。在全球范围内，70%的花生作物种植于相对盐碱旱薄地区［3，4］。因此加强花生耐盐性研究，发展盐碱地花生生产，在提高盐碱地区资源利用率方面具有重要作用。

脱落酸（abscisic acid，简称ABA）是高等植物中普遍存在的一种植物调节激素，具有促进叶片和果实脱落，促进芽休眠和抑制萌发，抑制生长、促进衰老等作用。Bueno等［5］最早在烟草中发现过氧化物酶（POD）的活性在ABA处理后明显升高，缓解了过氧化氢对烟草植株的伤害。盐胁迫下，ABA处理可通过减少玉米活性氧（ROS）的产生提高抗逆性［6］。2002年，研究人员发现ABA处理可通过提高植物体内抗氧化酶［超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽还原酶（GR）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）］的活性提高抗逆性［7］。目前ABA被公认为能够诱导植物产生对不良环境的抗性，是植物的“抗逆诱导因子”。

ABA生物合成途径的关键基因包括编码玉米黄质环氧化酶的ZEP基因、编码9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶的NCED基因和编码钼辅因子硫酸化酶的LOS5基因等［8-11］。Park等［8］在拟南芥中过表达AtZEP基因，盐胁迫条件下转基因植株生长更旺盛。Aswath等［12］将豇豆VuNCED1基因转化匍匐剪股颖，盐胁迫时可增加内源ABA的含量，提高转基因植株的存活率。Zhang等［13］将拟南芥LOS5基因转入玉米后，改善了根细胞离子通道和叶片含水量，耐盐性得以提高；将LOS5基因分别转入甘薯和黄瓜后，转基因植株醛氧化酶活性显著提高，ABA积累增多，耐盐性增强［14，15］；LOS5基因转入水稻和大豆后，转基因植株均表现出良好的抗逆性［16，17］。因此，ABA生物合成相关基因在植物逆境胁迫中起着重要的调控作用，可能具有重要的育种应用价值。

为了探究花生ABA途径抗逆基因AhLOS5的耐盐性功能，本研究以野生型（WT）三生烟、T1代AhLOS5过表达以及RNAi转基因烟草株系为研究对象，进行了耐盐性生物学功能分析，以期为进一步研究AhLOS5基因的功能，并指导花生耐盐育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2020年4月在泰安市农业科学院生物工程研究所进行。三生烟（Nicotiana tabacumL.cv.Samsun）温室常规管理。转基因烟草株系为本实验室前期获得：AhLOS5基因过表达株系和RNAi株系分别通过携带AhLOS5基因相关片段的pBI121正义表达载体和反义表达载体，农杆菌介导法转化三生烟叶片获得。其中正义表达载体携带AhLOS5基因全长cDNA；反义表达载体携带与烟草中LOS5基因同源性达84.07%的269 bp片段，该片段位于1288～1557 bp，最长的完全一致序列长度为28 bp，符合RNAi要求。本试验所用转基因株系为T1代正义转基因株系LOS5-9和反义转基因株系LOS5-R-7。

1.2 RNA提取

采用RNA simple总RNA提取试剂盒（QIAGEN公司）提取，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

1.3 Northern blot检测

将经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的RNA转移至尼龙膜上，65℃杂交箱预杂交12 h；以α-32P-dCTP标记的目标基因片段为探针，65℃过夜杂交；杂交后的膜于2×SSC（含0.1%SDS）及0.2×SSC（含0.1%SDS）洗液中清洗2次；将尼龙膜与X-光片紧密贴合，置于X射线曝光暗盒中，放置在-80℃冰箱中放射自显影48 h。在暗室中经显影、停影和定影，观测Northern blot检测结果。

1.4 转基因烟草耐盐性测定

幼苗根长测定：将野生型与正义和反义转基因植株的T1代种子分别播种于1/2MS培养基上，置于25℃光照培养箱（16 h光照/8 h黑暗）。萌发后，选择生长一致的烟草苗各20株，分别置于含有100 mmol/L NaCl的1/2MS液体培养基（NaCl）和正常1/2MS液体培养基（CK），7 d后测量根长。

叶片萎蔫症状检测：将生长至6叶期的野生型和正义以及反义转基因烟草各20株带根部取出，自来水洗净土壤，浸入含100 mmol/L NaCl溶液的1/2MS液体培养基。以正常1/2MS液体培养基处理为对照（CK）。盐胁迫处理4 d后观察植株叶片萎蔫程度。

1.5 转基因烟草理化指标的测定

将种子用75%乙醇清洗3 min，用含50 mL Tween-20、有效氯2.6%的NaClO消毒10 min，无菌ddH2O（含100 mL Tween-20）清洗2次。将消毒后的烟草种子播于筛选培养基（1/2MS培养基，含卡那霉素100 mg/L，羧苄青霉素250 mg/L）上，4℃培养3 d，转到28℃培养7 d。7 d后选择根系发达、叶色浓绿的幼苗进行移栽，室温生长7 d后进行理化指标测定。叶绿素含量、丙二醛含量（MDA）、相对电导率、抗氧化酶活性（APX、POD、SOD、CAT）、抗氧化物质含量（GSH和ASA）、脯氨酸（proline）及内源ABA含量测定方法参照《植物生理生化实验原理和技术》［18］，重复3次。

1.6 数据处理

采用Sigma Plot进行数据处理，用SPSS 21.0进行差异显著性分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 转烟草植株AhLOS5基因的表达量

Northern blot检测结果（图1）显示，转正义AhLOS5基因的烟草植株中AhLOS5基因过量表达，转反义AhLOS5基因的烟草植株成功抑制了AhLOS5基因的表达。

图1 烟草植株Northern blot检测结果

2.2 转基因烟草植株耐盐性

正常条件下，WT、LOS5-9与LOS5-R-7烟草幼苗平均根长分别为4.0、3.8、3.9 cm，差异不显著。盐胁迫条件下，WT和转基因烟草幼苗根长都较正常条件下的短，其中LOS5-9平均根长为2.9 cm，显著大于WT的1.7 cm和LOS5-R-7的1.4 cm（图2）。

图2 不同处理烟草幼苗根长

结果（图3）显示，盐胁迫下，转基因和WT烟草植株叶片均出现不同程度的萎蔫。LOS5-9转基因植株萎蔫症状轻微，WT和LOS5-R-7烟草植株均出现明显的萎蔫症状。

图3 植株叶片萎蔫程度检测

2.3 过表达AhLOS5转基因植株耐盐机制

2.3.1 盐胁迫下烟草植株的细胞膜完整性 盐胁迫下，植物会受到过氧化伤害，导致叶绿素生物合成降低、分解加速，表现为MDA含量和相对电导率上升，叶绿素含量下降。结果（图4）表明，正常生长条件下，转基因与WT烟草植株MDA含量、相对电导率和叶绿素含量无显著差异。盐胁迫下转基因和WT烟草植株的MDA含量、相对电导率均显著升高，叶绿素含量显著降低。LOS5-9转基因植株MDA含量和电导率升幅最小，WT烟草植株次之，LOS5-R-7转基因植株升幅最大。LOS5-9转基因植株叶绿素含量降幅最小，WT烟草植株次之，LOS5-R-7转基因植株降幅最大。表明过表达AhLOS5转基因植株细胞膜受盐胁迫的伤害较小。

图4 盐胁迫下转基因烟草植株电导率、MDA和叶绿素含量变化

2.3.2 盐胁迫下烟草植株抗氧化酶活性和抗氧化物质含量 SOD、POD、APX和CAT是植物体内4种重要的抗氧化酶。SOD是活性氧清除系统中第一个发挥作用的抗氧化酶，在活性氧大量生成的部位催化超氧离子的歧化反应；POD、APX和CAT也是清除植物活性氧的关键酶。GSH和ASA可以清除由盐胁迫诱导的过量活性氧；ASA还是维持APX活性的重要物质［19］。

结果（图5）表明，正常生长条件下，转基因与WT烟草植株4种抗氧化酶活性以及两种抗氧化物质含量均无显著差异。盐胁迫下转基因和WT烟草植株的抗氧化酶活性和抗氧化物质含量均显著升高，其中LOS5-9转基因植株抗氧化酶活性和抗氧化物质含量升幅最大，WT烟草植株次之，LOS5-R-7转基因植株升幅最小。

图5 盐胁迫下烟草植株抗氧化酶活性和抗氧化物质含量变化

2.3.3 盐胁迫下烟草植株内源ABA和脯氨酸含量 ABA是植物内源合成的重要激素之一，盐胁迫下ABA增加可引起气孔关闭，减少水分蒸腾，还可通过促进植物根的生长并抑制茎的生长实现对盐胁迫的应答。脯氨酸是一种重要的渗透调节物质，可以保护植物在遇到逆境时免受进一步的伤害。由图6可知，正常生长条件下，植物体内源ABA和脯氨酸的含量均较低，野生与转基因植株间无显著差异。盐胁迫条件下，烟草植株体内的ABA及脯氨酸含量急剧增加，LOS5-9转基因植株的升幅最大，WT植株次之，LOS5-R-7转基因植株升幅最小。其中LOS5-9转基因植株的内源ABA和脯氨酸含量比WT烟草植株分别高35.26%和40.97%，比LOS5-R-7转基因植株分别高72.87%和1.38倍。

图6 盐胁迫下烟草植株内源ABA和脯氨酸含量变化

2.4 盐胁迫相关调控基因的表达分析

为明确过表达AhLOS5基因提高转基因烟草耐盐性的作用机理，对其他抗逆相关基因在转基因烟草中的表达模式进行了Northern blot检测，包括P5CS、RD22和DREB2B。根据前人研究，DREB2B编码一个与DRE顺式作用元件结合的反式作用因子，通过调控DRE基因提高植物抗逆性，是不依赖ABA的抗逆途径［20］。RD22的启动子中具有胁迫应答转录因子MYC和MYB顺式结合位点，是依赖ABA抗逆途径中的重要基因［21，22］。P5CS是催化脯氨酸生物合成的关键酶，参与依赖ABA的抗逆胁迫途径［23］。

结果（图7）显示，在WT烟草植株中，P5CS、RD22和DREB2B基因在正常条件下都有较低水平的表达，盐胁迫可以诱导3个基因的超表达，说明3个基因都参与了植物抗盐反应。在LOS5-9转基因植株中，P5CS和RD22两个基因受胁迫诱导表达的程度明显高于WT烟草植株，而DREB2B基因的诱导表达程度则与WT植株无显著差异。LOS5-R-7转基因植株中，盐胁迫仅显著诱导DREB2B基因的超表达。说明AhLOS5与P5CS和RD22相同，都属于ABA途径相关的抗逆基因。

图7 盐胁迫下抗逆相关基因在烟草中的表达

3 讨论与结论

植物抵御逆境胁迫的途径可分为两类，即依赖内源ABA的抗逆途径和不依赖ABA的抗逆途径。依赖ABA的抗逆途径可引起内源ABA的积累，且对外源施加的ABA发生显著的生物学效应，这一信号传导途径称为依赖ABA的信号传导途径［22，24］。逆境胁迫时，外源喷施ABA可以增强抗氧化酶活性，降低活性氧含量，防止叶绿素降解，增大叶片相对含水量，减小质膜透性及丙二醛含量，增强PSⅡ的修复功能。在盐胁迫下，植物体内ABA含量迅速增加，可降低叶片伸展率，调整保卫细胞离子通道；抑制气孔开放、促进气孔关闭，保持正常生命活动［25，26］。

在转ABA生物合成相关基因的转基因植株中，内源ABA积累是一个共性特征，包括转AtZEP基因的拟南芥，转NCED基因的番茄、拟南芥、烟草［8-10，27］。Xiong等［28］在2002年发现非生物胁迫下内源ABA的生物合成机制：首先渗透压的改变诱导了NCED的表达，启动了逆境胁迫ABA生物合成的第一步；ABA含量的波动引起随后一系列ABA生物合成相关基因的表达，包括AAO、LOS5以及ZEP等基因，更增加了ABA的生物合成；这种多基因互作的协同效应最终使植株内源ABA积累量迅速增加。与本试验结果一致。转基因植株ABA通过调控许多受内源ABA诱导的胁迫应答基因，启动了更多的生物合成，使得植物的抗逆性进一步增强。这也可以解释本试验中正义转基因烟草在盐胁迫下根长更长、胁迫耐受性更强的现象。

活性氧是植物盐胁迫环境下产生的有害物质，可损坏细胞膜，造成膜脂过氧化，同时引起MDA在细胞中积累和相对电导率升高，影响细胞中蛋白质的合成。胁迫产生的ABA信号同时会激活细胞内多种抗氧化酶活性，包括SOD、POD、CAT和APX，这些过氧化物酶可以清除细胞中的活性氧，以保护细胞免受过氧化伤害［7］。本试验结果显示，在盐胁迫下，转基因植株和非转基因植株都出现了MDA积累和相对电导率增加的现象；而正义转基因植株的抗氧化酶活性更高，MDA含量和相对电导率更低。

为进一步证明过表达AhLOS5转基因烟草耐盐性是由盐胁迫诱导产生的内源ABA调控的，本试验选取了另外3个胁迫相关基因，研究其在不同烟草植株中的表达模式。结果显示，在正义转基因植株中，4个抗逆基因都受到盐胁迫的诱导而超表达；而在反义转基因植株中，盐胁迫只能诱导不依赖ABA途径的DREB2B基因的超表达，却不能诱导ABA途径的P5CS和RD22的过量表达。证明了LOS5基因的抗逆途径与DREB2B不同，而与P5CS、RD22相同，都属ABA途径的抗逆基因，过表达AhLOS5基因的转基因烟草植株获得的耐盐性是由胁迫诱导产生的内源ABA调控的。本研究为进一步探索AhLOS5基因在花生抗逆育种中的应用提供了理论基础。