瞬时过表达MnERF2基因对桑树耐盐性的影响

董亚茹，聂玉霞，李云芝，赵东晓，耿兵，王照红

（山东省蚕业研究所，山东 烟台 264002）

土壤盐渍化是自然界常见的逆境，全世界约有20%的耕地受到盐渍化威胁，严重影响了植物的生长、光合作用及生物量积累、产量等［1，2］。植物对非生物胁迫的反应受到多种因素的影响，涉及大量抗性基因的表达与调控，因此要提高植物对逆境的抗性就要从一些关键的调节转录因子着手。AP2/ERF类转录因子是植物特有的与胁迫应答有关的转录因子超家族。该类转录因子都具有1个或2个由60～70个氨基酸残基组成的非常保守的AP2/ERF结构域。Sakuma等［3］依据AP2/ERF转录因子的AP2结构域相似性将其划分为5大类，即AP2、ERF、DREB、RAV和Soloist。不同植物中AP2/ERF转录因子及其各亚家族成员的数量存在差异。桑树中共鉴定到116个AP2/ERF转录因子家族成员，其中ERF 58个，AP233个，DREB 21个，RAV 3个，Soloist 1个［4］。

20世纪90年代，第一个AP2/ERF转录因子从拟南芥中分离出来，研究表明其参与调控了花的发育过程［5］。事实证明，AP2/ERF转录因子不仅参与调控植物的生长发育，在响应低温、干旱、高盐、缺氧、高温等逆境胁迫方面也起到非常重要的作用［6，7］。拟南芥中AtCBF3基因可以诱导编码脯氨酸合成关键酶的表达，增加体内游离脯氨酸含量，提高植株的耐寒性［8］。过表达AtERF1基因的转基因拟南芥植株同时表现出对高温、高盐及干旱的耐受性，形态学观察发现植株通过减小叶片气孔孔径以降低水分流失［9］。覃利萍［10］在对刚毛柽柳的研究中发现ThCRF1转录因子可以促进海藻糖和脯氨酸的生物合成以及提高SOD和POD活性，从而提高植物对盐胁迫的耐受性。Yao等［11］发现拟南芥ERF74和ERF75受缺氧胁迫诱导，通过调控缺氧响应基因的表达来提高植株的缺氧耐受能力，同时敲除ERF74和ERF75的突变体植株表现出对淹水胁迫较高的敏感性。高温胁迫下拟南芥AtCBF3显著表达，与野生型相比，转AtCBF3基因的马铃薯植株ROS积累量减少，光合作用显著提高，表现出更强的耐高温性［12］。此外，AP2/ERF类转录因子也参与乙烯的生物合成及信号传导。

本研究将MnERF2基因过表达载体（pROKⅡ-MnERF2）、抑制表达载体（pROKⅡ-MnERF2-SRDX）瞬时转入桑树中并通过NaCl胁迫使其表达，比较分析了不同转基因植株的耐盐生理指标，初步鉴定MnERF2的功能，以期为桑树及木本植物耐盐分子机制研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试桑树品种为杂交种桂桑优12，种子购于广西蚕业技术推广总站。试验于2021年3月在山东省蚕业研究所组培实验室进行。挑选饱满一致的种子，在超净台中用75%乙醇消毒1 min，然后用5%次氯酸钠消毒10 min，最后用无菌水冲洗5次，铺种到装有MS培养基的培养皿中。一周后挑选萌发无菌的种子移栽到装有MS培养基的组培瓶中，每瓶4颗种子，以此获得大量无菌桑树植株，用于瞬时侵染试验。植物过表达载体（pROKⅡ-MnERF2）、抑制表达载体（pROKⅡ-MnERF2-SRDX）由本实验室构建保存。MnERF2属于ERF亚家族，GenBank登录号为XM_010106513，由本实验室从桂桑优12中克隆获得。

1.2 MnERF2基因过表达和抑制表达载体瞬时转化桑树

选择生长一致的1个月左右的桑树无菌苗，将构建好的MnERF2基因过表达载体（pROKⅡ-MnERF2，OE）、抑 制 表 达 载 体（pROKⅡ-MnERF2-SRDX，RNAi）和空载体（pROKⅡ，WT）分别瞬时侵染桑树组培苗，侵染方法参照Ji等［13］的描述。桑树植株在1/2MS培养基中培养48 h后移至含有100 mmol·L-1NaCl的1/2MS培养基中，在胁迫处理0、6、12、24、48 h取整株桑树材料，经液氮速冻后保存于-80℃冰箱，用于后续试验。

1.3 MnERF2基因瞬时表达桑树的抗逆生理指标测定

1.4 实时荧光定量PCR

用植物RNA试剂盒提取桑树植株总RNA，并反转录成cDNA。将反转录产物稀释10倍，选择MnRPL15和β-actin作为内参基因，引物见表1，由上海生工生物有限公司合成。RT-PCR反应体系为：TB Green PremixEx Taq10μL，基因特异性上下游引物各1μL（10μmol·L-1），模板2 μL，补ddH2O至20μL。每个测试样品进行3次重复试验。反应程序按照TB Green PremixEx Taq（TaKaRa No.RR820Q）说明进行，在CFX96 Real-Time PCR Detection System仪器（Bio-Rad Bio.CA.USA）上完成。RT-PCR数据利用2-△△Ct法［21］进行分析。

表1 RT-PCR引物及其序列

2 结果与分析

2.1 MnERF2基因瞬时表达桑树植株的获得

NaCl胁迫48 h后对MnERF2基因瞬时表达量进行RT-PCR分析，结果（图1）显示，MnERF2基因在瞬时过表达（OE）株系中的表达量最高，在抑制表达（RNAi）株系中最低。表明已成功获得了瞬时过表达和抑制表达MnERF2基因的桑树植株。

图1 MnERF2基因瞬时转化桑树植株qRT-PCR检测

2.2 MnERF2基因瞬时表达桑树植株的抗性生理研究

2.2.1 ROS及MDA含量的变化 NaCl胁迫后，MnERF2基因OE株系中的、H2O2、·OH和MDA含量均低于野生株，而RNAi株系中的含量高于野生株，且随着处理时间的延长，各株系中的、H2O2、·OH和MDA含量均不断增加。胁迫48 h时，OE株系的、H2O2、·OH和MDA含量分别比野生株降低了17.67%、34.42%、30.24%和27.40%，而RNAi株系分别比野生株升高了27.45%、46.17%、21.74%和9.71%（图2）。

图2 NaCl胁迫不同时间转基因和野生桑树中ROS和MDA含量的变化

2.2.2 抗氧化酶活性 NaCl胁迫后，MnERF2基因OE株系中SOD、POD、CAT、GST活性均强于对照，RNAi株系中则均弱于对照，且随着处理时间的延长各株系中的四种保护酶活性均不断增加。胁迫48 h时，OE株系的SOD、POD、CAT、GST活性分别比野生株提高了36.05%、23.86%、37.98%、24.46%，RNAi株系的则比野生株降低了28.16%、29.32%、23.74%、22.24%（图3）。

图3 NaCl胁迫不同时间转基因和野生桑树中SOD、POD、CAT和GST活性的变化

2.2.3 渗透调节物质含量 NaCl胁迫后，MnERF2基因OE株系中AsA、GSH、脯氨酸含量均高于对照，而RNAi株系中均低于对照，随着处理时间的延长均不断增加。胁迫48 h时，OE株系的AsA、GSH、脯氨酸含量分别比野生株提高41.73%、22.47%、34.47%，RNAi株系则分别比野生株降低25.18%、18.32%、31.03%（图4）。

图4 NaCl胁迫不同时间转基因桑树和野生桑树中AsA、GSH和脯氨酸含量的变化

2.3 抗氧化酶基因表达分析

由于胁迫48 h的抗氧化酶活性最高，因此对该时间SOD、POD、CAT三种酶基因的表达量进行分析，结果（图5）显示，MnERF2基因的OE株系中三种酶基因的表达量均显著高于对照，而RNAi株系中三种酶基因的表达量均显著低于对照。

图5 NaCl胁迫48 h转基因和野生桑树中抗氧化酶基因的表达量

3 讨论与结论

转录因子可以与启动子内的顺式元件相互作用，调节下游基因的转录，在植物抵抗非生物胁迫中具有重要作用［22］。因此，发掘抗非生物胁迫相关转录因子，研究其抗逆分子机制，能够为植物抗逆分子改良提供重要数据和材料。已有研究显示，不同植物的ERF转录因子通过调控胁迫响应基因，在高盐度、干旱和低温等非生物胁迫响应中发挥重要作用［23-26］。本研究前期在桑树盐胁迫转录组数据分析中发现ERF基因响应盐胁迫的诱导，并从中筛选到一个上调表达倍数较高的ERF基因，命名为MnERF2，推测其在桑树耐盐响应中发挥一定功能。

为了验证MnERF2基因的耐盐功能，分析桑树响应盐胁迫的生理生化变化，本研究分别构建植物过表达载体（pROKⅡ-MnERF2）及抑制表达载体（pROKⅡ-MnERF2-SRDX），通过农杆菌介导的高效瞬时遗传转化获得了MnERF2基因瞬时过表达（OE）、抑制表达（RNAi）桑树植株，RT-PCR检测结果显示，MnERF2基因在OE植株中的表达量显著高于在RNAi植株中，表明获得了瞬时表达桑树植株，这与在拟南芥［21］、白桦［27］、柽柳［28］上的研究结果类似，可用于后续抗逆功能的研究。

活性氧（ROS）是有氧代谢的副产物［29］。当植物遭遇盐和干旱胁迫时，ROS会过度积累，导致DNA、脂类、蛋白质的损伤，最终导致氧化应激［30］。通过抗氧化系统清除ROS，可将ROS保持在较低的稳态水平［31］。盐胁迫可以显著影响植物细胞质膜脂质过氧化，从而改变质膜渗透性，调节离子的渗透模式，盐胁迫引起的这种膜损伤也与ROS的增加有关［32］。MDA是脂质过氧化作用的最终产物，其积累量反映了氧自由基引起的细胞膜损伤程度［13］。为此，本研究分别对NaCl胁迫条件下MnERF2基因过表达、抑制表达及野生桑树植株的ROS和MDA含量进行比较分析，结果显示，随着胁迫时间的延长，过表达MnERF2基因可以降低桑树在盐胁迫下的O2·-、H2O2、·OH和MDA含量，说明MnERF2基因可以降低盐胁迫下的氧化应激，从而保护细胞膜、减轻损伤，具有一定的耐盐性。

为了避免ROS过度积累造成的氧化损伤，植物自身抗氧化系统会通过提高抗氧化酶活性和非酶物质来清除ROS。谷胱甘肽S-转移酶（GST）是一种多功能酶，在外源性物质的解毒和应激代谢中起着至关重要的作用，是植物在逆境条件下的重要因子，可防止氧化损伤［33］。拟南芥AtGSTU19在盐度和干旱条件下表达上调，柽柳ThGSTZ1基因在干旱和盐胁迫下表达上调［34，35］。本研究中，过表达MnERF2基因可以显著提高桑树在盐胁迫下的SOD、POD、CAT、GST活性，具有正向调控作用，从而增强ROS清除能力，进而提高桑树的耐盐性。这与前人［28，36］的研究结果类似。

抗坏血酸（AsA）具有抗氧化作用，能有效清除羟基自由基和过氧化物［37］。谷胱甘肽（GSH）是一种低分子量的硫醇，广泛分布在动植物中［38，39］，可以直接去除活性氧，是一种重要的抗氧化剂［40］。同时，GSH作为GST的底物，具有活性氧清除作用［38］。游离脯氨酸（Pro）可以调节细胞膜的渗透性，在稳定膜和蛋白质等生物大分子结构方面发挥作用，起到对盐、干旱和污染物胁迫的抗性作用［41］。本研究中，过表达MnERF2基因可以使盐胁迫桑树中的AsA、GSH、脯氨酸含量显著高于对照和抑制表达植株。由此可见，MnERF2能够通过控制盐胁迫下AsA、GSH、脯氨酸的生物合成来增加植物的抗氧化物质含量，提高渗透势，最终提高植物的耐盐性。

综上所述，盐胁迫下过表达MnERF2基因可通过增强抗氧化酶SOD、POD、CAT、GST活性，增加抗氧化物质和渗透调节物质含量，增强ROS清除能力，减少细胞受损或死亡，从而提高桑树的耐盐能力。