含ACC脱氨酶的根际促生菌对切花月季生长及生理的影响

李文祥，张天谣，贾颜，刘松，李茜，倪功，黄海泉，黄美娟

（1.西南林业大学园林园艺学院/国家林业和草原局西南风景园林工程技术研究中心/云南省功能性花卉资源及产业化技术工程研究中心/西南林业大学园林园艺花卉研发中心，云南 昆明 650224；2.云南锦苑花卉产业股份有限公司，云南 石林 652208）

切花月季（Rosa hybrida）为蔷薇科蔷薇属常绿、半常绿花卉，作为世界四大鲜切花之一备受消费者喜爱，具有良好的观赏和经济价值。‘伊芙伯爵’作为切花月季品种，具有花量多、花朵大、花型美、重瓣性强的特点，并带有浓浓的老玫瑰花香，深受人们的喜爱，但其生长速度相对较慢，目前生产实践中常通过大量施用化肥、农药来提高其产量和品质，久而久之易造成土壤板结、养分失衡和环境污染等问题，不仅影响切花月季的产量和品质，而且对人类健康及生存环境构成极大的威胁［1］，生产过程中兼顾生态效益对于该产业可持续发展具有重要意义。对根际生态中的植物-土壤-微生物互作过程的研究发现，植物根际促生菌在促进植物生长的同时，还能够改良土壤中的微生态环境，因此不仅能提高作物产量及品质，而且有利于减少化肥、农药等的施用［2］，降低生产成本及环境污染。

植物根际促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是对植物根际有益微生物的统称，能与植物相互作用，从而改善植物生长［3-6］。其中，含ACC（1-氨基环丙烷羧酸）脱氨酶的PGPR可分解ACC（乙烯合成直接前体）［7］，减少乙烯生成，延缓植物衰老，在干旱、重金属等逆境条件下能显著提高农作物的抗逆性和产量。如宋金秋等［8］从绞股蓝种植土壤中分离到7株具ACC脱氨酶活性的细菌，其中表现最优的菌株可使水稻幼苗的根长提高1.6倍，根鲜重增加。Khalifa等［9］在盐生植物根际分离出两面神菌属、芽孢杆菌属和枯草芽孢杆菌属共3株产ACC脱氨酶菌株，接种小麦后均能显著促进其生长。Santana等［10］发现接种根际促生菌芽孢杆菌能缓解干旱导致的高粱光合速率降低。然而，目前尚未见将含ACC脱氨酶的PGPR应用于切花月季栽培中的研究报道。本研究以市场上热销的切花月季栽培品种‘伊芙伯爵’为材料，研究具有ACC脱氨酶活性的PGPR对其生长及生理指标的影响，筛选出对其有促生作用的菌株，从而为切花月季环境友好型生物菌肥的生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验所用菌株为本实验室前期分离筛选到的具ACC脱氨酶活性的7株菌，具体信息见表1。长势一致的‘伊芙伯爵’切花月季扦插苗由云南锦苑花卉产业股份有限公司提供，苗高约10 cm。

表1 含ACC脱氨酶的菌株信息

1.2 试验设计

1.2.1 菌悬液制备 挑取ADF固体培养基（ACC为唯一氮源）中的单菌落接种于TSB液体培养基，28℃、200 r/min振荡培养至OD600nm为0.5后于4℃、8000 r/min离心15 min，收集菌体，并以原体积无菌水重悬，得到单菌的菌悬液。混合菌液为7种单菌菌悬液以等比例混合而成。

1.2.2 试验设计 将多菌灵原粉按8～10 g/m2的比例拌入栽培基质（草炭土、黄土、珍珠岩以10∶3∶2比例混合而成）中进行消毒杀菌，并晾晒3天，采用无纺布种植袋（35 cm×30 cm）种植月季扦插苗，缓苗一个月后，对其根部进行菌悬液浇灌处理，设置单菌F195组、F105组、F11组、F23组、L11组、L74组、Z22组及混合菌液Mix组8个处理，每袋浇灌50 mL菌悬液与800 mL无菌水，以纯无菌水浇灌作为对照（CK），每个处理4株，重复3次。

1.3 测定指标及方法

于菌悬液处理第60天，测量月季株高、茎粗、分枝数、花径、叶绿素相对含量（SPAD）、叶片超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性、丙二醛（MDA）含量和花朵乙烯释放量（ethylene production，EP），并对光合作用指标和叶绿素荧光参数进行测定。

1.3.1 SOD、POD、CAT活性和MDA含量的测定 参考高俊凤［11］的方法测定。

1.3.2 SPAD及叶绿素荧光的测定 选取上、中、下部叶片，使用叶绿素仪（SPAD 502，精度0.1 SPAD）测定叶绿素相对含量。利用调制叶绿素荧光成像系统（IMAGING-PAM，S/N：IKEB0261，IMAG-CM，德国）在叶片暗适应30 min后，测定初始荧光（Fo）、最大荧光（Fm）、实际光化学效率（ΦPSⅡ）、非光化学淬灭系数（qN）、光化学淬灭系数（qP）和表观光合电子传递效率（ETR），并计算最大光化学效率（Fv/Fm）。

1.3.3 叶片光合特性的测定 采用LI-6400 XT便携式光合作用测定系统（内置专用红蓝光源叶室）在晴天9∶00—11∶30及15∶30—17∶00选择植株顶部生长点向下第3～5片功能叶测定气孔导度（Gs）、净光合速率（Pn）、胞间CO2浓度（Ci）和蒸腾速率（Tr），并计算水分利用效率（Pn/Tr）。

1.3.4 花朵乙烯释放量的测定 利用便携式乙烯分析仪CI-900测定单朵花在5 min内的乙烯释放量。

1.4 数据统计分析

数据用SPSS 26.0进行统计分析，用Duncan’s法进行多重比较（α=0.05），用Microsoft Excel 2019作图。

2 结果与分析

2.1 含ACC脱氨酶的不同PGPR菌株对‘伊芙伯爵’主要农艺性状的影响

如表2所示，所有菌株处理的月季株高均显著高于对照，以F195菌株处理的最高，达68.1 cm，较对照增加56.91%，菌株F105处理的次之，L11菌株处理的最低，但仍高于对照23.73%。除Z22菌株处理的月季茎粗显著低于对照外，其余菌株处理的茎粗均与对照差异不显著，仅F23处理的茎粗略高于对照。除F105和F11外，各菌株处理的分枝数均略高于对照，但未达差异显著水平，其中混合菌株处理的分枝数最多，显著高于F105处理。各菌株处理的花径均与对照无显著差异，仅F23菌株处理的略大于对照。可见，含ACC脱氨酶的各菌株能够显著促进月季‘伊芙伯爵’的株高增长，但对茎粗、分枝数和花径的影响较小。

表2 含ACC脱氨酶的不同PGPR菌株对‘伊芙伯爵’主要农艺性状的影响

2.2 含ACC脱氨酶的不同PGPR菌株对‘伊芙伯爵’叶片MDA含量及叶绿素相对含量的影响

PGPR菌株处理能降低‘伊芙伯爵’叶片的MDA含量，提高叶绿素相对含量（图1）。混合菌株处理对MDA含量的降低幅度最大，F23和F195次之，分别为对照的63.58%、72.52%和77.32%，差异达显著水平。各单菌处理能增加叶片中的叶绿素含量，其中F195菌株处理的SPAD值显著高于对照12.87%，而混合菌株处理的SPAD值略降低，但与对照差异不显著。

图1 含ACC脱氨酶的不同PGPR菌株对‘伊芙伯爵’叶片MDA含量及叶绿素相对含量的影响

2.3 含ACC脱氨酶的不同PGPR菌株对‘伊芙伯爵’花朵乙烯释放量与叶片抗氧化酶活性影响

从图2可以看出，混合菌株和单菌Z22处理能够促进‘伊芙伯爵’花朵的乙烯释放，但与对照差异不显著；其余菌株处理均能减少花朵的乙烯释放量，尤以F195菌株处理的减幅最大，乙烯释放量仅为对照的64.54%。除L11和Z22菌株处理略降低SOD活性外，各单菌和混合菌株处理均能提高月季叶片的抗氧化酶活性，其中，F195菌株处理的SOD、POD、CAT活性分别显著高出对照38.64%、58.45%、1.17倍，F11菌株的SOD活性显著高出对照42.03%，其余菌株处理均与对照差异不显著。

图2 含ACC脱氨酶的不同PGPR菌株对‘伊芙伯爵’花朵乙烯释放量及叶片抗氧化酶活性的影响

2.4 含ACC脱氨酶的不同PGPR菌株对‘伊芙伯爵’光合特性的影响

从表3可以看出，相比于对照和各单菌处理，混合菌株处理降低了‘伊芙伯爵’叶片的Pn、Gs、Ci和Tr，与对照差异达显著水平。各单菌处理中，与对照相比，F11菌株显著提高了Pn，达到对照的1.07倍，而F105、F23、L74、Z22均显著降低了Pn；F195菌株处理显著提高了Gs，达到对照的2.15倍；F195、F105、F11、F23菌株处理显著提高了Ci，分别是对照的1.25、1.17、1.19、1.25倍，其余菌株处理与对照差异不显著；F195、F11、F23显著提高了Tr，分别高于对照75.8%、49.5%、24.2%，而其余菌株处理均显著降低了Tr。菌株L11和混合菌株显著提高了‘伊芙伯爵’的水分利用效率，增幅分别为50.0%和42.6%，而F195、F11、F23菌株处理的水分利用效率均显著低于对照，其余菌株处理则与对照差异不显著。

表3 含ACC脱氨酶的不同PGPR菌株对‘伊芙伯爵’光合特性的影响

2.5 含ACC脱氨酶的不同PGPR菌株对‘伊芙伯爵’叶绿素荧光特性的影响

从表4可以看出，与对照相比，施入不同PGPR单菌或混合菌对月季叶片的Fv/Fm、qP无显著影响，但显著降低ΦPSⅡ；除F195菌株处理的qN外，PGPR处理降低qN和ETR，其中L11和Mix的qN显著低于对照，除F195、F23、L74外的其余菌株处理ETR均显著低于对照。综合来看，菌株处理后，各荧光参数均没有显著高于对照，表明PGPR菌株处理对光合作用的提高可能并不直接来源于对叶绿素荧光特性的改善，而是存在其他机制。

表4 含ACC脱氨酶的不同PGPR菌株对‘伊芙伯爵’叶绿素荧光特性的影响

3 讨论与结论

植物与存在于其生活环境中的微生物有着紧密联系，长久的进化使其在植物生长和逆境适应中扮演着不可或缺的角色。已有研究揭示，PGPR存在多个机制刺激植物生长，包括能进行生物固氮作用［12，13］、合成激素（IAA、GA3以及细胞分裂素等）［14］、对抗病原菌［15，16］、产铁载体［17］、具有解磷能力［18-20］等。本试验结果显示，含ACC脱氨酶的不同PGPB菌株处理对‘伊芙伯爵’株高都有显著促进作用，这与舒健虹［12］、戚秀秀［21］等的研究结果类似。另一方面，含ACC脱氨酶的PGPR能够降解ACC为α-酮丁酸和氨，使乙烯低于抑制植物生长的水平，最终达到促生长的效果，一般表现为根系数量的增加，进而促进其适应和生存［22，23］。本试验中，菌株F195处理后的月季花朵乙烯释放量显著低于对照，在提高抗氧化酶活性方面也表现出了较其他菌株处理更好的效果，并显著降低了MDA含量。这可能与菌株F195拥有最高的ACC脱氨酶活性相关。

光合作用贯穿于植物生长发育的各个阶段并最终决定植物的生产量［24］。本研究中，与对照相比，菌株F195、F11和F23处理后的叶片蒸腾速率显著提高，而水分转运以及植物吸收地下营养物质依靠蒸腾作用，并且植物光合作用和氧化代谢中多余的热能也是通过蒸腾作用散出。菌株F195也显著提高了其气孔导度，气孔张开度的增加有利于大气中的CO2进入，从而进一步促进光合作用的进行及植物的生长，这与内生细菌对芳樟光合特性的影响［25］结果相似。然而，菌株处理虽然都显著增加了株高，但仅菌株F11处理的净光合速率显著高于对照，胞间CO2浓度、蒸腾速率也均显著高于对照，这可能与其处理后的叶绿素含量较高有关；另外，F195菌株处理的气孔导度、胞间CO2浓度、蒸腾速率也均显著高于对照，净光合速率略低于对照，但差异不显著，说明植物的净光合速率不仅与叶片厚度、成熟度、光合色素含量等密切相关，还会受到外部环境因素如温度和光照强度等的影响［26］。

叶绿素荧光参数能反映出植物光合作用的内在复杂过程［27-30］。秦嗣军等［29］利用从野生东北山樱根际分离到的3株PGPR菌株接种盆栽东北山樱幼苗，发现接种腊质芽孢杆菌对叶绿素荧光参数无影响，而接种松鼠葡萄球菌后，幼苗的最大光化学效率增强。但Paradi等［30］在不同梯度磷养分条件下用丛枝菌根真菌聚生球囊霉接种长叶车前，得到丛枝菌根真菌对长叶车前最大光能转换效率影响不显著的结论。本研究结果也表明，接种含ACC脱氨酶的不同PGPR菌株也不能显著提高切花月季的叶绿素荧光参数，有的菌株甚至会产生显著的抑制作用。

综合来看，接种植物促生菌可以使切花月季‘伊芙伯爵’株高增加，分枝增多，叶绿素含量增加，花朵乙烯释放量减少，对其生长产生一定的促进作用。目前普遍认为，PGPR对植物生长的影响是间接的，通常是通过改善土壤理化特性来提高根系对水分和营养元素的吸收来促进植物生长和发育。这种间接作用可能才是接种PGPR菌株显著提高切花月季株高的主要原因。此外，本试验使用的菌株来自于不同的属，如假单胞菌属、寡养单胞菌属、芽孢杆菌属，均是植物根际促生菌的主要来源属［31-33］。探索更多属菌株的促生作用将有助于植物根际促生菌资源的丰富及开发利用。