高浓度煮浆对豆腐品质提升的作用及其机制

吴元浩，李 玥，金雪花，徐婧婷，郭顺堂,*

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.植物蛋白与谷物加工北京市重点实验室，北京 100083）

将大豆浸泡、破碎、滤渣后获得的生豆乳进行加热处理，是豆乳和豆腐的生产中非常关键的工艺环节[1]。热处理不仅灭活生豆乳中致病菌、钝化胰蛋白酶抑制剂等抗营养因子，而且还能提升豆制品的安全、营养与感官特性[2-3]。豆乳在热处理时，豆乳蛋白的存在状态和聚集性也发生了变化，即随着加热温度的升高，豆乳中蛋白质发生变性，生豆乳中破碎的蛋白体颗粒以及油脂体为核心的粒子开始解离，蛋白质亚基之间在热的作用下进行重组，形成游离油脂体、溶解性蛋白和粒子蛋白组分[4]，在质子或钙离子的作用下，各组分的表面电荷被中和，在疏水相互作用下形成豆腐凝胶[5]。

目前，国内外学者针对豆乳加工中的煮浆条件已开展大量研究。左峰等[6]探究了微压煮浆对豆乳中蛋白聚集体和豆腐品质的影响，微压煮浆所得豆乳中蛋白粒子含量增加，豆乳平均粒径减小，使得豆乳的黏度提高，豆腐的硬度提高。Liu Zhisheng等[7]采用两步加热的煮浆方式，豆乳黏度增加，豆腐的弹性增强。不同豆乳浓度在煮浆过程中也产生不同的效果。Wallace等[8]对熟豆乳浓缩后进行二次煮浆，高浓度下的豆乳产生热诱导凝胶，凝胶强度随豆乳浓度增加而升高。Wan Yangling等[9]对不同浓度的大豆分离蛋白溶液进行加热，然后调整成相同固形物含量后制备酸凝胶，结果显示，高浓度热处理组Zeta电位绝对值增大，酸凝胶过程中凝固时间提前，凝胶速率加快，凝胶硬度增加。生产实践中豆乳的制备浓度因大豆原料品种的差异以及不同豆制品加工企业的加工方式存在差异，豆乳饮料行业为降低成本也采取高浓度煮浆后稀释调配的生产工艺，但高浓度煮浆是否有利于提升豆腐凝胶品质，对这一问题鲜有研究报道。

本研究聚焦豆乳中蛋白聚集体的状态，利用不同浓度豆乳进行煮浆处理，加热后稀释至同一固形物浓度，再制成豆腐，以生产中常用的固形物质量分数为8%的豆乳为对照，比较豆腐凝胶的品质，进一步从豆乳蛋白聚集体及流变学的角度分析了高浓度煮浆对豆乳蛋白聚集体和凝固过程的影响，其结果为优化豆乳品质、调控豆乳凝固速率为核心的豆制品加工技术开发提供了一定的理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆 市售；消泡剂 常州三蜂食品添加剂有限公司；熟石膏 广东百味源食品配料有限公司；十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠、盐酸、浓硫酸、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、脲、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三氯化铁、甘氨酸等（分析纯） 北京化学试剂公司；中性滤纸、考马斯亮蓝G-250 美国默克公司；牛血清白蛋白、β-巯基乙醇 美国Amresco公司；二甲基硅油 西陇化工公司。

1.2 仪器与设备

打浆机 九阳股份有限公司；UV-1800紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；LXJ-IIB低速离心机 上海安亭科学仪器厂；CP80MX超高速离心机 日本日立公司；CT3质构仪 美国Brookfield公司；Nano-ZS90电位粒径仪美国马尔文公司；LS230型粒度分布仪 美国贝克曼-库尔特公司；电子天平 日本AND公司；JB-1磁力搅拌器上海雷磁新泾仪器有限公司；DHR-2动态流变仪 美国TA公司；DK-S24水浴锅 上海森信实验仪器有限公司；LS-55荧光分光光度计 美国珀金埃尔默公司；BE-210N垂直电泳槽 日本生物耗材公司；DYY-III8B稳压稳流定时电泳仪 北京六一仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 豆乳及豆腐的制备

每份取50 g大豆，自来水洗3次后去离子水洗2次，加入150 g去离子水，在冰箱冷藏层浸泡14 h，沥干后再加入250 g常温去离子水，于打浆机中磨浆2.5 min，加入适量的消泡剂，经脱脂棉抽滤除渣，得生豆乳。测定生豆乳中固形物质量分数，并通过加入去离子水调整固形物质量分数至12.2%、11.2%、10.2%、9.2%（高浓度）和8.0%，摇匀后，取相同质量的生豆乳在沸水浴中加热到95 ℃后，继续加热5 min，并不断摇动。加热结束后立即降至室温，在熟豆乳中加入等温去离子水，调整固形物质量分数至8.0%，制得样品，用于后续测定豆乳指标。制备豆腐时，将固形物质量分数调整至8.0%的豆乳冷却到85 ℃，加入豆乳质量0.3%的熟石膏，通过磁力搅拌器搅拌10 s，然后85 ℃水浴保温15 min形成凝乳。对凝乳适当破碎，倒入9 cm×7 cm×5 cm模具中，然后在500 g/63 cm2压力下压榨15 min，之后再在1 000 g/63 cm2的压力下压榨15 min。排出豆乳清（黄浆水）后，得到石膏豆腐，冷藏于冰箱。

1.3.2 豆腐得率与质构特性测定

将制备好的豆腐置于室温条件，豆腐得率以豆腐质量计算（每次点浆前均使用300 mL固形物质量分数为8%的熟豆乳）。参考Imm等[10]所述方法并加以修改，测定豆腐的质构特性时，去掉豆腐的不均匀外皮，切成长、宽、高为15 mm×15 mm×10 mm的长方体，进行全质构分析（texture profile analysis，TPA）循环测试，其中探头型号TA 25/1000，形变量为40%，测试速度为0.05 mm/s。根据TPA曲线得到豆腐的硬度、弹性和咀嚼性。

1.3.3 豆腐的水分质量分数与保水性测定

参考王睿粲[11]所述方法，将铝盒放入105 ℃烘箱中烘至恒质量，记录质量（m0/g），加入豆腐后捣碎，记录样品及铝盒的质量（m1/g），烘至恒质量后，记录烘后质量（m2/g），豆腐的水分质量分数计算如公式（1）所示。

根据Chen Zhenjia[12]等的方法，称取一定质量与形状的豆腐样品，置于带有特殊网状内管（质量为m0/g）的50 mL离心管中，记录质量m1/g，离心（1 000 r/min、10 min）后取出网状内管及样品，记录质量m2/g。保水性通过公式（2）计算。

1.3.4 豆乳中蛋白质量分数及蛋白粒子比例的测定

按照Ono等[13]所述方法，通过超高速离心机将豆乳在156 000×g、20 ℃下离心30 min，沉淀为直径大于40 nm的粒子部分。采用Bradford[14]的方法测定蛋白质量分数，分别测定离心前豆乳中蛋白质的质量分数（即豆乳中的蛋白质量分数）ω1/%和经超速离心后豆乳可溶蛋白质量分数ω2/%，豆乳中蛋白粒子比例计算如公式（3）所示。

1.3.5 豆乳粒径分布的测定

参考Ion-Titapiccolo等[15]的方法，用Na2HPO4·12H2O-KH2PO4缓冲液[16]稀释豆乳为原浓度的1/100，吸取1 mL稀释液，通过电位粒径仪测定平均粒径。参考Chen Yeming等[17]的方法，粒径测量范围40 nm～2 000 μm。加入一定量样品，待浓度稳定后进行测定。以Na2HPO4·12H2O-KH2PO4缓冲液为溶剂，折射率1.33，蛋白粒子折射率1.57，粒径分布以不同直径粒子的体积百分比表示。

1.3.6 豆乳的Zeta电位测定

参考左峰[18]所述方法，并略有改变，用Na2HPO4·12H2O-KH2PO4缓冲液稀释豆乳样品为原浓度的1/100后，用电位粒径仪测定Zeta电位。每个样品测定3次，重复4次，取平均值。溶剂参数选择：折光系数1.33，黏度1.008 7 mPa·s。

1.3.7 豆乳蛋白的疏水性测定

参考Haskard等[19]所述方法并略有改变，将一定量豆乳样品中加入4 mL 1/15 mol/L pH 7.1磷酸盐缓冲液，分别稀释为样品浓度的1/500、1/800、1/1 000、1/2 000、1/4 000系列溶液，随后添加20 μL 8 mmol/L 8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）荧光探针，混合均匀，通过荧光分光光度计来测定样品的荧光强度。激发波长390 nm，发射波长470 nm，以10 nm为激发和发射狭缝宽，扫描速率为200 nm/min。以蛋白质量分数为自变量，荧光强度为因变量，拟合线性方程得到斜率S0，即蛋白表面的疏水性指数。

1.3.8 豆乳及其组分的电泳分析

参考Wang Ruican等[20]所述方法取约含蛋白2 mg的豆乳样品加入1.5 mL的离心管中，按顺序加入0.5 mL处理液（质量分数20%甘油、质量分数0.2% SDS、pH 6.8的0.063 mol/L Tris-HCl缓冲液）、0.36 g脲、20 μL巯基乙醇以及20 μL的饱和溴酚蓝溶液，加纯水使总体积最终为1 mL，混匀后静置过夜。采用垂直电泳平板，胶板厚1 mm。分离胶为质量分数12.5%的丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液，交联度为2.7%；浓缩胶为质量分数4%的丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液，交联度2.7%。电泳缓冲液含有5 mmol/L Tris、38.4 mmol/L甘氨酸和质量分数0.1%SDS。样品上样量为8 μL。电泳过程中，浓缩胶部分保持15 mA恒定电流，分离胶部分保持25 mA恒定电流。电泳结束后，对电泳胶片用含有体积分数33%甲醇和12%三氯乙酸固定液在摇床上处理3 h。固定后，在考马斯亮蓝染色液（质量分数12%三氯乙酸、1.05 mmol/L考马斯亮蓝G-250、1.0 mol/L硫酸、10 mol/L氢氧化钾）中染色3 h。随后进行脱色，直至条带清晰，底色基本透明。为表示豆乳中各亚基的相对含量，使用Scion Image软件进行光密度分析，计算时分析α’、α、β、A、B亚基所占比例。

1.3.9 豆乳凝固过程的动态流变学分析

参考Wang Ruican等[21]所述方法，取19 mL在冷藏层贮存的豆乳，加入1 mL含有0.06 g的熟石膏均匀悬浮液，迅速搅拌10 s，立刻把混合液加到流变仪的平行板（直径40 mm）间，狭缝设为1 mm，在较小平板周围滴加少量二甲基硅油。加入样品后，迅速升温至蹲脑温度85 ℃，保持15 min，得到储能模量G’和损耗模量G”与时间t的函数曲线。豆乳凝固过程符合一级动力方程，按经验公式（4）[22]拟合。

式中：G’sat代表饱和弹性模量（即弹性模量到达稳定区间的值）；t0/s与k/（10－3s－1）分别代表凝固开始的时间（即G’准备离开基线的时间）和凝固速率；t－t0表示G’离开基线后的时间。

1.4 数据统计与分析

所有实验重复3次，结果以平均值±标准差表示，采用SPSS软件以方差分析（AVONA）检验平均值之间的差异显著性，显著性水平为P＜0.05。数据及图像处理使用Excel 2016、Origin 2017和SPSS软件。

2 结果与分析

2.1 豆腐质构、得率与保水性分析

豆腐质构是反映其品质最直接的指标，不同类别豆腐的软硬、弹性各不相同。一般来说，盐卤豆腐（北豆腐）的硬度高于石膏豆腐（南豆腐），而内酯豆腐最软，这些指标与消费者的偏好相对应。通过制备含不同固形物质量分数的生豆乳，煮浆后添加去离子水统一熟豆乳的固形物质量分数，比较高浓度煮浆制得石膏豆腐的质构特性。如表1所示，随着煮浆浓度的增加（固形物质量分数9.2%～12.2%），豆腐的硬度从613 g左右逐渐降低至450 g左右，煮浆时固形物质量分数在11.2%的豆乳制备的豆腐与未经高浓度煮浆的8.0%组的豆腐在硬度、咀嚼性上最为接近。与固形物质量分数8.0%组相比，高浓度煮浆组豆腐样品弹性略有上升。而豆腐得率、水分质量分数在各处理组间没有太大差异，保水性的变化与硬度变化类似。豆腐的保水性随着煮浆浓度的上升而降低，但仍高于固形物质量分数8.0%组。

表1 不同浓度煮浆所得豆乳制备豆腐的质构特性与得率、保水性、水分质量分数Table 1 Texture, yield, water-holding capacity and moisture content of tofu prepared from different concentrations of raw soybean milk

2.2 豆乳中蛋白聚集体的变化

2.2.1 豆乳蛋白质量分数和蛋白粒子比例

生豆乳中蛋白质在加热过程中会发生解离和聚集生成可溶性蛋白质和粒子状态的蛋白质。如图1所示，随着加热时豆乳固形物质量分数增加，其中的蛋白质量分数不发生显著变化。随着加热时豆乳固形物质量分数从9.2%升高至12.2%，蛋白粒子的比例从26.2%升高至49.0%。高浓度煮浆中固形物质量分数10.2%组与8.0%组蛋白例子比例相近。结果表明，高蛋白浓度有利于蛋白解离后有更大的相互反应机率，形成更多的蛋白聚集体，进而提高了蛋白粒子比例。

图1 不同浓度煮浆所得豆乳中蛋白质量分数与粒子比例Fig. 1 Proportions of protein particles and protein contents in cooked soybean milk of different concentrations

2.2.2 豆乳的粒径分布分析

生豆乳蛋白受热变性后，豆乳中蛋白质结构展开，亚基从原有结构中解离，聚集成新的粒子，并产生蛋白质和磷脂包裹在脂肪周围的油脂体中[23]，豆乳粒子的分布特性与豆乳加工特性紧密相关。如图2所示，在同样的热处理条件下，随着煮浆时豆乳浓度的提高，粒子粒径显著增大（P＜0.05），这一结果与Mehalebi等[24]在球蛋白体系中得到的结果一致。从豆乳的粒径分布来看（图3），加热后豆乳的粒径分布呈双峰状，峰值所对应的粒径分别为600 nm和2 000 nm左右。有报道指出，豆乳中蛋白粒子在40～200 nm左右[17]，而油脂体单体在122～657 nm左右，融合的油脂体粒径在1 μm以上[25]。由此可见，图3中的第一个峰可能是蛋白粒子和油脂体单体的混合物，而第二个峰是油脂体的聚合体。另外，从图3还可以看出，随着煮浆浓度的增加，第一个峰所占面积比例逐渐减少，而第二个峰所占面积比例呈现增加状态，且峰型整体向右侧移动。这一结果说明，高浓度下煮浆会使单体油脂体聚合，单体油脂体的比例减少，同时形成更多体积较大的油脂体。

图2 不同浓度煮浆所得豆乳蛋白粒子平均粒径Fig. 2 Average sizes of protein particles in cooked soybean milk of different concentrations

图3 不同浓度煮浆所得豆乳粒子粒径分布Fig. 3 Particle size distribution of proteins in cooked soybean milk of different concentrations

2.2.3 豆乳的Zeta电位分析

Zeta电位表示的是带电微粒表面剪切层的电位，常用来表征微粒的电荷性质。当微粒体系带电绝对量过低时，体系倾向于聚集[26]。不同浓度加热后调制的豆乳Zeta电位如图4所示，5种浓度下加热所得豆乳的Zeta电位值均低于－10 mV，表明这5 类豆乳体系是相对稳定的。但随着加热豆乳蛋白浓度（固形物质量分数8%～11.2%）的增加，粒子负电性增强，在固形物质量分数为11.2%时，电位绝对值达到最大。这一结果与Wan Yangling等[9]关于蛋白热聚集粒子增大和负电性增强的结果一致。

图4 不同浓度煮浆所得豆乳Zeta电位变化Fig. 4 Zeta potential of cooked soybean milk of different concentrations

2.2.4 豆乳蛋白的疏水性分析

豆乳中的蛋白质在受热解离后，会在疏水相互作用、二硫键、氢键等作用力下重新聚集，形成豆乳蛋白粒子。本研究通过对豆乳疏水性的测定，进一步分析了不同煮浆浓度所得豆乳的蛋白变性情况，结果如图5所示。总体上，随着煮浆浓度的提高，蛋白的疏水性逐渐降低，煮浆时固形物质量分数为11.2%与12.2%时疏水性低于8.0%组。疏水性能够直接反映蛋白的变性程度，蛋白质受热后，三级结构展开，疏水基团暴露，会导致更强的疏水性。但随着加热时蛋白浓度的增加，暴露出更多的疏水基团[27]，在疏水相互作用下疏水基团相互聚集，进而导致荧光猝灭，会显著降低荧光量子产率[28]，导致疏水性降低。同时，在聚集的过程中，疏水侧链内折，使得更多带负电的极性氨基酸暴露，导致豆乳的Zeta电位绝对值随煮浆浓度增加而增大，这与图4的变化趋势一致。因此，高浓度下加热导致豆乳蛋白结构展开，并进一步聚集，形成聚集程度更高的结构。

图5 不同浓度煮浆所得豆乳疏水性变化Fig. 5 Hydrophobicity of cooked soybean milk of different concentrations

2.2.5 SDS-PAGE电泳分析

图6为不同浓度下加热所得豆乳经超高速离心（156 000×g、30 min）的蛋白粒子电泳图。经光密度分析，随着煮浆浓度的增加，蛋白粒子中B亚基的比例增大，而α与α’亚基比例减小。已有研究表明11S的B亚基和7S的β-亚基倾向于形成粒子蛋白的核心，7S的α、α’亚基以及11S的A亚基则倾向于分布在粒子蛋白的外围[29]。可见，提高煮浆浓度导致的蛋白粒子比例增加可能与粒子中B亚基比例上升有关。

图6 不同浓度煮浆所得蛋白粒子还原电泳图Fig. 6 Reduced electrophoresis pattern of proteins in cooked soymilk of different concentrations

2.3 豆乳凝固过程中流变学特性分析

动态流变学测试能够监测流体体系流变学性质随时间的变化，进而能够反映豆乳的凝胶过程。由图7可知，当煮浆的豆乳固形物质量分数达到11.2%时，凝固速率显著加快，开始凝固时间t0显著早于9.2%和10.2%组的豆乳以及8.0%组。在受热的过程中，蛋白质变性展开，疏水基团暴露，导致蛋白开始聚集，当蛋白达到较高浓度时，聚集体间进一步聚集形成凝胶。在豆乳凝固的过程中，大豆蛋白发生两步聚集[30]，高浓度豆乳可能在受热过程中聚集程度较高，蛋白变性后形成小聚集体，并进一步形成较大的聚集体，进而导致蛋白在凝固过程中凝固时间提前，同时凝固速率加快。

图7 不同浓度煮浆对豆乳凝固速率k（A）与开始凝固时间（B）的影响Fig. 7 Rate k (A) and start time (B) of coagulation of cooked soymilk of different concentrations

3 结 论

不同的煮浆浓度会影响豆乳中蛋白聚集反应，导致豆乳中蛋白的状态和性质发生变化，并进一步影响豆乳凝固过程和豆腐凝胶的品质。高浓度煮浆对于豆腐的品质有着显著影响，随着煮浆浓度的增加，豆腐的硬度、咀嚼性逐渐降低，其中煮浆浓度在固形物质量分数为9.2%时硬度、咀嚼性达到最大，煮浆浓度在固形物质量分数为11.2%与8.0%时所得豆腐的硬度、咀嚼性相近，而弹性、得率、水分质量分数和保水性差异较小。产生这一现象的原因是煮浆浓度的不同改变了豆乳的加工性质，高浓度煮浆使豆乳中蛋白聚集程度增强，粒子蛋白部分B亚基比例提升，α’和α亚基比例减少，同时豆乳中蛋白粒子比例呈上升趋势，粒径不断增大。高浓度下煮浆，随煮浆浓度增加，蛋白基团在疏水相互作用下聚集，导致体系中疏水性降低，而Zeta绝对值电位升高。随着加热时蛋白的浓度升高，初级聚集形成的线股聚集体或球形聚集体会进一步结合成分形团簇，成为较大的聚集体。较高的聚集程度使豆乳凝胶凝固时间提前，凝固速率加快。高浓度煮浆的豆乳导致体系中存在较大的蛋白聚集体和融合的油脂体，过快的凝胶速率可导致进一步形成不均匀且空隙疏松的网络结构。这一结果表明，通过调控豆乳的煮浆浓度能够优化豆乳品质，调控凝固速率，为生产不同产品特性的豆腐制品提供理论支持。