代谢流分析在C HO细胞代谢研究中的应用进展

彭婷 综述，梅文枫 审校

福建医科大学免疫治疗研究院，福建福州 350122

由于CHO细胞能进行正确的翻译后修饰，如蛋白折叠、糖基化，且其表达的重组蛋白可分泌至胞外，更便于后续纯化，已成为抗体药物的首选表达宿主［1-2］。为建立高表达、稳定、质量可控的重组CHO细胞株及培养工艺，研究者已从营养底物优化［3-5］、代谢工程［6-8］、过表达抗凋亡基因［9-10］、信号转导［11］等多个方面来改善CHO细胞性能［12］。

代谢流分析（metabolic flux analysis，MFA）又称代谢通量分析，可通过同位素示踪剂绘制胞内流动的代谢途径来量化这些代谢表型，其综合底物吸收及产物形成速率、生物合成、化学计量反应、中间代谢物的生物合成等数据，可为重新构建细胞代谢提供关键的量化信息。目前，越来越多的研究结合MFA，从多维度来改善CHO细胞性能，以建立稳定的重组CHO细胞。13C-MFA是以13C标记实验为基础的MFA，已成为探讨宿主细胞工程改造后的变化及指导培养基和生物工艺优化的重要工具之一［13］。本文就13C-MFA流程及近年MFA在CHO细胞代谢研究中的应用进展作一综述。

1 13C-MFA流程

13C-MFA一般流程包括设计同位素标记实验、同位素标记实验、标记物信息测定、代谢流计算、统计分析［14］。

1.1设计同位素标记实验 同位素标记实验的设计仍是一项具有挑战性的任务，选择合适的同位素和标记策略对估算通量精确度的影响较大，因此标记底物的选择和优化对胞内代谢流的计算至关重要［15-16］。最新的开源软件IsoDesign有助于选择合适的同位素，这是一款用于MFA实验设计，通过优化输入同位素组成使参数最大化的软件，其包括1个可视化模块，该模块可根据待处理的生物问题直观地选择输入最佳标签，同时用户可定义每个同位素含量的上下限，有助于限制同位素成本［17］。D-葡萄糖是常用的底物，其标记类型有两种：一种是特定位置13C标记的葡萄糖，如［1，2-13C2］葡萄糖；另一种是全标记葡萄糖［U-13C6］。不同代谢途径的计算需不同标记方法，METALLO等［15］对碳原子采用18种标记方法，通过比较，得出［U-13C6］标记的葡萄糖对估算三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA）途径的通量值比较有效，而［1，2-13C2］葡萄糖和［1-13C］葡萄糖能提供糖酵解和氧化磷酸戊糖途径（oxidative pentose phosphate pathway，oxPPP）上的信息。TEMPLETON等［18］在研究CHO细胞中抗体的产生与氧化代谢之间的联系时，选择的是50%［1，2-13C2］、30%［U-13C6］和20%［1-13C］标记的葡萄糖。近年来，13C不仅标记于葡萄糖上的碳原子，还标记于丙酮酸、谷氨酰胺上的碳原子，多种标记底物组合增加了中间体标记，对流量估算值起到精准的补充。DEAN等［19］不仅对葡萄糖上的碳进行标记，同时对丙酮酸［2-13C］和谷氨酰胺［U-13C5］进行了标记；AHN等［20］也对谷氨酰胺的［U-13C5］进行了标记。设计中不仅要结合实验需求合理选择标记底物，同时也要考虑标记底物的成本，从而以较低的实验成本获得更多的通量信息。因此在实验设计中，生物反应器容积应尽量小，可考虑尝试微小型生物反应器，如赛多利斯的Ambr15。

1.2同位素标记实验 在标记实验中，选择合适的方式进行细胞培养，在培养过程中根据设计好的同位素标记策略于选定的时间点添加13C标记底物，并进行取样，测量营养物和细胞产物（如葡萄糖、氨基酸、乳酸、生物质）的生产速率和消耗速率。（拟）稳态假设是MFA的重要前提，稳态可分为代谢稳态和同位素稳态，其中代谢稳态指的是细胞胞内代谢通量保持不变，一般呈现于培养对数的中后期。根据取样时同位素异构体的组成是否己达到稳态，可将代谢流分为稳态代谢流和非稳态代谢流两种［21-22］。非稳态代谢流的优点是同位素标记底物用量少、节省成本、耗时短、获得的胞内代谢信息更多、计算结果相对更精确［23-24］；其缺点是计算复杂、样品多且要进行快速取样，需高精准度的代谢物检测设备。非稳态代谢流分析方法尚需进一步发展和完善，目前已有相关开源软件，如OpenMebius、INCA。

1.3标记物信息测定 目前，同位素标记测定应用最广泛的方法是气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）、液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）和核磁共振（nucleic magnetic resonance，NMR）。MS检测具有灵敏度高、分析时间短、设备费用低和检测物质种类多的优点；NMR虽然测试灵敏度较低，谱图解析较困难，但数据分析发展较为成熟［25］。近年来该领域有了新进展，即采用串联MS来测量同位素分布［26］，CHOI等［27］实验证明，串联MS也能为MFA提供信息数据，并能测量完整的同位素分布；JEFFREY等［28］实验也表明，与单独的MS或NMR比较，串联MS在13C代谢分析中具有更高灵敏度。底物标记物的选择决定检测方式能否获取最多的信息数据，因此在实验设计中检测方法的选择与同位素标记策略应综合考虑［29］。

1.4代谢流计算 在13C-MFA中，通量估算需要数学模型结合统计学分析来完成［30］，其目标是找到最适合通量值，该值能匹配胞外代谢速率和同位素标记的数据［31-32］。目前，主要有比率分析法和全局迭代拟合法两种计算方法［33］。在早期MFA中，研究人员需以自己编写程序代码来分析数据，较繁琐，也限制了MFA的发展。近年来，开发了多种软件用于数据分析，如可用于通量估算的Metran和Open-Flux［34-35］，再如INCA［36］和OpenMebius［37］软件能灵活使用单个建模平台执行稳态或非稳态代谢流的计算，另外，INCA还具有执行同位素模拟、优化实验设计和对限制途径进行分析的功能。目前已有多种可结合MFA自动化辅助数据处理和步骤可视化的软件，见表1［38］，这些软件简化了数据分析工作流程，减少了开发定制软件代码的负担，使MFA的应用越来越广泛。

表1 公开可用的MFA软件列表Tab.1 List of publicly available software tools for 13CMFA

1.5统计分析 MFA是对实际通量的模拟，估算的代谢通量值与实际实验测量结果有一定差异，有时存在较大偏差。因此估算代谢通量值后，必须评估拟合优度，以确定拟合是否在统计学上可接受。在数据分析中，拟合优度通过计算残差平方和（sum of squared residual，SSR），即测量值与模拟值之间的加权平方差来评估［32］。CROWN等［39］建议对SSR进行χ2统计检验，若SSR值落在统计可接受的范围内，则接受拟合；若SSR超出可接受范围，则必须重新评估网络模型和测量数据，直至获得可接受的SSR值。另外，统计学分析重要指标之一是通量的置信区间，该指标可反映通量值估算的确定性，确定准确的置信区间有两种首选方法：一种是基于评估SSR对通量变化的敏感性来模拟［40］，另一种是使用蒙特卡罗模拟。

2 MFA在CHO细胞代谢研究中的应用

1999年，NYBERG等［41］利用MFA通过γ-CHO细胞在无血清培养基中验证来源于肽的氨基酸代谢，随后20年来，MFA在CHO细胞代谢中的应用得到迅速发展，现在可通过该技术从多方面深入研究CHO细胞代谢和营养需求，包括代谢途径、营养底物优化、代谢表型、细胞生长阶段、代谢工程等方面的研究。见表2［6-7，9，18-20，41-63］。

表2 MFA在CHO细胞代谢研究中的应用情况Tab.2 Overview of metabolic flux analysis studies in metabolisn of CHO cells

2.1代谢途径研究 MFA能够表征细胞代谢能力，识别细胞代谢途径的控制节点［64］，对某些代谢途径的重要性进行准确描述。MFA所关注的途径通常为中心碳代谢途径，包括糖酵解、TCA、PPP途径，也包括部分生物合成途径，如氨基酸生物合成。NYBERG等［42］通过MFA估算得出CHO细胞表达的IFNγ糖基化与TCA通量有关，而不是糖酵解。SENGUPTA等［7］利用MFA研究CHO细胞晚期非增长期的代谢，对糖酵解和PPP途径分析表明，几乎所有消耗的葡萄糖均流向PPP，且伴随产生高水平的NADPH；几乎所有糖酵解产生的丙酮酸均进入TCA，几乎无乳酸产生。

2.2营养底物优化研究 MFA也能够阐明CHO细胞如何响应营养需求和替代补料［46，55-56，58，61］。谷氨酰胺是培养基中重要成分之一，添加的量对细胞代谢会产生不同程度的影响，SHEIKHOLESLAMI等［55］对不同浓度的谷氨酰胺进行了MFA比较，发现在蛋白表达期间许多关键的胞内通量均受到谷氨酰胺含量影响；TORRES等［61］利用半乳糖和乳酸来代替葡萄糖，得到一个平衡更好和更有效的代谢表型。

2.3代谢表型比较的研究 许多研究通过MFA分析不同代谢表型的胞内代谢或代谢差异的关键节点，如DEAN等［19］将高表达表型与低表达表型的细胞系进行MFA比较，研究其各自表型相关的内在代谢谱；SHEIKHOLESLAMI等［54］也利用MFA进行了诱导重组蛋白表达和无诱导重组蛋白表达的胞内流量图分布的比较研究，查找代谢差异；2017年，TEMPLETON等［65］利用MFA研究11株不同代谢表型的克隆细胞早期平台期IgG表达对应的代谢，发现表达抗细胞凋亡Bcl-2Δ基因的克隆细胞与IgG表达量增加相关。

2.4细胞生长阶段研究 细胞生长曲线是培养细胞生物学特性的基本参数之一，许多研究对CHO细胞生长的不同阶段进行了研究［6，18，52，57］，如TEMPLETON等［18］利用13C-MFA计算CHO细胞流加培养4个阶段的代谢流，发现比生长速率峰值与高乳酸产量和最小TCA有关，当TCA和抗体表达量达到峰值时，比生长速率持续减小；当TCA和oxPPP通量达高值时，活细胞密度开始下降。AHN等［52］通过MFA显示，细胞增长期至非增长期胞内代谢通量具有明显的重新分配和变化，包括能量代谢、氧化还原代谢、oxPPP途径和回补途径。

2.5代谢工程研究 目前，较多研究是通过MFA阐明CHO细胞经基因工程技术诱导重组蛋白表达［42］、抗凋亡因子表达［9，57］、敲除某基因改造后的变化［62］，如TEMPLETON等［9］发现，表达Bcl-2Δ基因在乳酸产生阶段通过胞内丙酮酸再次流向线粒体氧化来减少乳酸的积累，且在乳酸消耗阶段显著增加了乳酸的再摄取；WILKENS等［62］利用CRISPR/Cas技术敲除LDHa基因，来提高细胞代谢。

3 小结与展望

MFA是一种用于确定活细胞内代谢通量的技术，该方法所需的GC-MS、NMR等实验仪器较为昂贵，样品处理、数据测定分析较复杂，且同位素标记成本较高，因此在一定程度上阻碍了该技术的发展，但近年该技术已在代谢工程、系统生物学、生物医学和生物技术中广泛应用，是建立稳定、高表达、质量可控的重组CHO细胞株的强大工具之一。通过MFA技术可从多方面研究CHO细胞，如以碳为中心的代谢途径、细胞培养不同阶段、细胞代谢表型的比较、基因工程技术改造后的变化、替代补料的响应、重组蛋白表达的差异等。随着同位素标记实验不断优化，进一步提高了通量估算的质量，研究者能够通过更高的准确性和精确度来检测表型中通量更细微的差异，微小通量变化将为改良CHO细胞培养过程，通过代谢工程优化代谢途径，使建立灵敏早期检测代谢表型方法成为可能［14］。同时，MS和NMR不断更新的方法能从13C标记实验中提取更多信息，该进展使MFA可应用于更广泛的实验系统中，或有选择性地检测特定途径。随着同位素标记实验方法的改进和优化、标记物信息测定新方法的建立和公开软件的持续开发，MFA在CHO细胞代谢研究中的应用将越来越广泛，越来越完善。