S AR S-C oV-2 S蛋白单克隆抗体的制备及其双抗体夹心E L I S A检测方法的建立

李妮，龙柏霖，朱文勇，钏鸿云，宋绍辉，刘婧，吴雅楠，廖国阳

1.中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所，云南 昆明 650118；

2.沈阳药科大学药学院，辽宁沈阳 110016

目前，由严重急性呼吸系统综合征症冠状病毒2型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）（简称新冠病毒）引起的新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）在世界范围内流行，感染者已超过2亿例，导致超过400万人死亡［1］。虽然美国食品药品监督局（Food and Drug Administration，FDA）已批准多种疫苗和药物用于预防和治疗SARS-CoV-2的感染和传播，但SARSCoV-2的传播感染仍在持续，目前在英国、南非、巴西、日本和印度均出现了多种新的SARS-CoV-2变异株［2］。因此，加速疫苗研发以控制疫情传播势在必行。

棘突蛋白（spike protein，S）是一类融合糖蛋白，是冠状病毒颗粒的主要表面蛋白和中和抗体的主要靶点［3］。新冠病毒S蛋白由S1和S2两个亚基组成，其中S1亚基包含1个与宿主细胞受体血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）结合的受体结合域（receptor binding domain，RBD），该结构域负责与宿主细胞膜上的hACE2和硫酸肝素相互作用，触发S蛋白融合前状态的不稳定，并随之转变为融合后构象；而S2亚基介导病毒与宿主细胞膜的融合［4-7］。宿主感染SARS-CoV-2后，S蛋白在诱导中和抗体和T细胞应答以及保护性免疫中起关键作用，其中S1亚基的RBD结构域可作为疫苗研发的靶点。而且当前国内外上市及在研的新冠疫苗除灭活疫苗和减毒活疫苗外，大多数疫苗均以S蛋白作为靶点［8］，因此，制备抗新冠病毒S蛋白的单克隆抗体（简称单抗），建立S蛋白定量检测体系，对于新冠疫苗定量十分必要。目前国内外新冠病毒抗原定量检测试剂盒价格均较昂贵，因此，本研究通过杂交瘤融合细胞技术制备高特异性的单抗，并建立双抗体夹心ELISA检测方法对新冠病毒S蛋白进行定量检测，以期为新冠病毒疫苗定量检测及S蛋白功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1病毒、细胞及疫苗 SARS-CoV-2武汉株灭活病毒液、灭活疫苗半成品、10份疫苗生产工艺不同阶段已知S蛋白抗原含量的样本、H3N2流感病毒液及H3N2单价原液均由中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所提供，SP2/0骨髓瘤细胞、Vero细胞碎片及培养上清均由该所生物制品五室提供。

1.2实验动物 SPF级健康BALB/c小鼠吗，雌性，6~8周龄，体重约20 g，购自中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所，动物合格证号：XDWSYB20210366。动物实验经中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所伦理委员会审查批准（XDWSYB20200409）。

1.3主要试剂及仪器 筛选用重组S蛋白（货号：40589-V08B1）、重组N蛋白抗原（货号：40588-V08B）、重组RBD抗原（货号：40592-V08H）和小鼠免疫球蛋白亚型鉴定试剂盒（货号：SEK003）均购自北京义翘神州生物技术有限公司；HRP标记的羊抗鼠IgG、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、HAT干粉、HT干粉、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂和PEG-4000均购自美国Sigma公司；细胞筛、培养皿、细胞培养板及酶标板购自美国Corning公司；RPMI1640培养基购自德国BI公司；胎牛血清购自美国GIBCO公司；HRP标记的兔抗新冠病毒S蛋白多克隆抗体和肺炎支原体由中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所生物制品五室提供，SARS-CoV-2灭活疫苗标准品604（640 U）、0.01 mol/L PBS和青霉素/链霉素双抗由该所提供；1、5、10 mL注射器和1.5、15、50 mL离心管均购自上海科进生物技术有限公司；AKTA蛋白系统及Hi Trap Protein G HP亲和层析柱购自美国GE公司；BCA蛋白定量检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司（货号：P0010S）；蛋白marker购自北京全式金生物技术有限公司（货号：DM131）；卵清蛋白购自北京索莱宝科技有限公司；新生牛血清购自兰州民海生物技术公司。

1.4单抗的制备及纯化

1.4.1动物免疫及效价测定 以SARS-CoV-2武汉株灭活病毒液作为免疫原免疫BALB/c小鼠，初次免疫取病毒液和弗氏完全佐剂各100μL，经背部皮下多点注射免疫；3周后取病毒液和弗氏不完全佐剂各100μL，经腹腔注射免疫；2周后进行第3次免疫，免疫剂量和方法同第2次免疫。免疫后1周经小鼠尾部采血，分离血清，检测血清抗体效价。对效价最高的小鼠取50μL病毒液进行脾脏免疫后待融合用。

1.4.2阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆 脾脏免疫后3 d进行融合。融合前1 d取空白BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞和胸腺细胞，按每孔1×104个接种96孔细胞培养板，置37℃，5%CO2恒温培养箱中培养。将待融合小鼠眼球采血后脱颈处死，按照文献［9］方法分离小鼠脾细胞，通过50%PEG进行融合，将融合细胞加入预先铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，100μL/孔，继续置37℃，5%CO2恒温培养箱中培养。待细胞长满约1/2时，取细胞上清液，采用间接ELISA法筛选阳性细胞株，选择阳性值较高的杂交瘤细胞进行亚克隆培养。

1.4.3单抗腹水的制备及纯化 将杂交瘤细胞培养至对数生长期，按1×106个/只注射入液体石蜡预先致敏的小鼠腹腔，7~14 d后无菌收集腹水，2 625×g离心10 min，分离腹水与上层油脂及下层沉淀，将腹水用0.45μm的滤膜过滤后，采用Protein G亲和层析柱纯化腹水，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度；10%SDS-PAGE分析单抗的纯度。

1.5单抗的鉴定

1.5.1结合位点鉴定 采用Western blot法。重组S蛋白变性后经10%SDS-PAGE分离，使用0.45μm PVDF膜200 V恒压转膜1.5 h；以5%脱脂奶粉4℃封闭过夜；加入获得的单抗（1∶3 000稀释），室温摇床孵育1 h；用TBST洗膜3次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG（1∶8 000稀释），室温摇床孵育1 h；洗膜5次，采用ECL高灵敏度显色液进行显色，凝胶成像仪拍照分析结果。

1.5.2亚型鉴定 利用小鼠抗体亚型检测试剂盒对杂交瘤细胞制备的腹水抗体进行亚型鉴定，操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.5.3效价及效应浓度测定 采用间接ELISA法。将1μg/mL重组S蛋白加入96孔酶标板，4℃包被过夜；加入纯化后的单抗，100μL/孔，37℃孵育1 h；加入HRP标记的羊抗鼠IgG（1∶8 000稀释），100μL/孔，37℃孵育1 h；加入TMB显色，用2 mol/L硫酸终止反应，上酶标仪测定A450值。将单抗按照2倍系列连续稀释后，采用同样方法进行测定，计算单抗的效应浓度。

1.5.4特异性验证 采用间接ELISA法。将重组S蛋白、N蛋白、武汉株灭活病毒液、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、BSA、脱脂牛奶、新生牛血清、H3N2流感病毒液分别加入96孔酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜；加入纯化的单抗（1∶3 000稀释），100μL/孔，37℃孵育1 h；加入HRP标记的羊抗鼠IgG（1∶8 000稀释），100μL/孔，37℃孵育1 h；加入TMB显色，用2 mol/L硫酸终止反应，上酶标仪测定A450值。

1.6双抗体夹心E LI S A检测方法的建立 将纯化的单抗用包被缓冲液（pH 7.2的0.01 mol/L PBS）稀释，加入酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜；PBST洗板3次，加入封闭液，250μL/孔，37℃封闭2 h；PBST洗板3次，加入SARS-CoV-2灭活疫苗标准品604（640 U）及待检样品，以0.01 mol/L PBS作为阴性对照，100μL/孔，37℃孵育1 h；PBST洗板3次，加入酶标抗体稀释液稀释的HRP标记的兔抗S蛋白多克隆抗体，100μL/孔，37℃孵育1 h；洗板5次，加入TMB，100μL/孔，37℃避光显色15 min；加入2 mol/L硫酸终止显色，50μL/孔，上酶标仪测定A450值。

1.7方法的优化

1.7.1包被抗体及酶标抗体浓度的确定 采用棋盘滴定法。将单抗用包被缓冲液稀释至10、5、2.5、1.25μg/mL，加入酶标板，4℃包被过夜；PBST洗板3次，用1%BSA于37℃封闭2 h；洗板3次，加入SARS-CoV-2灭活疫苗标准品604（640 U）作为阳性对照，0.01 mol/L PBS作为阴性对照，37℃孵育1 h；加入HRP标记的兔抗S蛋白多克隆抗体（用酶标抗体稀释液稀释至浓度为4、2、1μg/mL），37℃孵育1 h；其余步骤同1.6项。以阳性对照检测值（P）与阴性对照检测值（N）的比值（P/N）最大时对应的抗体浓度组合作为最适工作浓度。

1.7.2封闭液的确定 将包被抗体按1.7.1项确定的最适浓度加入酶标板，于4℃包被过夜；分别以不同封闭液（未封闭、PBS稀释的1%BSA、2%BSA、1%BSA+1%蔗糖、2%BSA+2%蔗糖）于37℃封闭2 h，每种封闭液设2个重复；加入1.7.1项的阳性标准品和阴性对照以及确定的最适浓度酶标抗体，其余步骤同1.6项。以P/N最大时对应的封闭液配方作为最适封闭液。

1.8方法的验证

采用SARS-CoV-2灭活疫苗标准品604对该方法进行验证。标准品中S蛋白抗原含量为640 U（1 U表示中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所疫苗定量检测体系的最低检测限）。

1.8.1线性范围及灵敏度 将灭活抗原标准品分别稀释为320、160、80、40、20、10、5、2.5 U（1 U为1个酶标单位），采用优化后的方法进行检测，每个浓度设3个重复。以标准品中S蛋白抗原含量为横坐标，A450值为纵坐标绘制标准曲线，获得回归方程，并计算相关系数（R2），确定标准曲线的线性范围。并采用优化后的体系检测51份阴性样本：Vero细胞碎片（11份）、0.01 mol/L PBS（10份）、MEM基础培养基（10份）、新生牛血清（10份）、Vero细胞培养上清液（10份）。在要求99%（单侧）可信度条件下，以吸光度均值+3倍标准差作为阳性判断值［10］，计算Cut-off值作为阴阳性样本的判断标准，根据Cutoff值判断该体系的灵敏度。

1.8.2特异性 用建立的方法分别对重组S蛋白、重组N蛋白、重组RBD蛋白、SARS-CoV-2武汉株灭活病毒液、SARS-CoV-2灭活疫苗半成品、肺炎支原体抗原、脱脂奶粉、0.01 mol/L PBS、BSA、H3N2单价原液、Vero细胞碎片、Vero细胞上清液、RPMI1640培养基、新生牛血清等14份样本进行检测，验证该方法的特异性。

1.8.3准确性 将SARS-CoV-2武汉株灭活病毒液稀释至200 U后，2倍系列稀释至高（100 U）、中（50 U）、低（25 U）3个浓度，将其作为标准物质，用建立的方法对S蛋白含量进行3次重复检测，按下式计算加标回收率［11］，验证该方法的准确性。

1.9方法的初步应用 用建立的方法对10份疫苗生产工艺不同阶段已知S蛋白抗原含量的样本进行检测，计算该方法与中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所新冠疫苗定量方法检测结果的符合率，评价该方法的实用性。

2 结果

2.1杂交瘤细胞株的筛选 3次免疫后，1~5号小鼠的血清效价分别为1∶51 200、1∶25 600、1∶25 600、1∶51 200和1∶102 400，5号小鼠血清效价最高，取其进行脾脏免疫后融合。经两轮亚克隆培养和筛选，最终获得18株分泌抗S蛋白特异性单抗的杂交瘤细胞株，分别编号为：1E8A1、04B6D10、4G12A5、4G12A12、4G12D9、4G12D7、4G12G1、4G12G9、4G12-G10、5B10B5、5B10C11、5B10E12、5B10G2、5H10A4、5H10B11、5H10B12、7B10A1和7B10A2，对1E8A1、7B10A1和7B10A2细胞株继续扩大培养后制备小鼠腹水抗体，其余细胞株冻存保种。

2.2单抗的纯度及浓度 7B10A2株单抗经Protein G柱亲和层析纯化，可见明显洗脱峰，且峰值较高，表明抗体含量较高，见图1。纯化后的单抗浓度为4.487 mg/mL。10%SDS-PAGE分析显示，纯化的单抗只可见相对分子质量为53 100和25 490的重链和轻链2个条带，抗体纯度大于90%，见图2。

图1 7B10A2株单抗的亲和层析图谱Fig.1 Affinity chromatographic profile of McAb secreted by 7B10A2 cell strain

图2 7B10A2株单抗纯度的SDS-PAGE分析Fig.2 Analysis of purity of McAb secreted by 7B10A2 cell strain by SDS-PAGE

2.3单抗的鉴定

2.3.1结合位点 Western blot分析显示，7B10A2株单抗可特异性结合新冠病毒S蛋白上S1亚基，见图3。

图3 Western blot分析7B10A2株单抗的特异性Fig.3 Analysis of specificity of McAb secreted by 7B10A2 cell strain by Western blot

2.3.2亚型 经鉴定，7B10A2株单抗为IgG2b型，见图4。

图4 7B10A2株单抗的亚型测定Fig.4 Determination of subtypeof McAb secreted by 7B10A2 cell strain

2.3.3效价及效应浓度 间接ELISA法测得纯化后7B10A2株单抗的效价为1∶128 000，效应浓度为0.137μg/mL。

2.3.4特异性 间接ELISA结果显示，7B10A2株单抗可特异性结合SARS-CoV-2重组S蛋白和武汉株灭活全病毒，而与重组N蛋白等其他成分不发生反应，见图5。表明该单抗为S蛋白特异性抗体。

图5 7B10A2株单抗的特异性验证Fig.5 Verificationforspecificityof McAbsecreted by7B10A2 cell strain

2.4双抗体夹心E LI S A法的优化

2.4.1最适包被抗体和酶标抗体浓度 当包被抗体浓度为5μg/mL，酶标抗体浓度为4μg/mL时，P/N值最大，为20.113，见表1。因此选择包被抗体及酶标抗体最适工作浓度分别为5和4.0μg/mL。

表1 包被抗体和酶标抗体工作浓度的优化Tab.1 Optimization of working concentrations of coating and enzyme labeled antibodies

2.4.2最适封闭液 以2%BSA+2%蔗糖封闭时，P/N值最大，为42.000，见表2。因此选择2%BSA+2%蔗糖作为最适封闭液配方。

表2 封闭液优化结果Tab.2 Optimization of blocking reagent

2.5方法的验证

2.5.1线性范围及灵敏度 标准品中S蛋白抗原含量在2.5～160 U范围内，A450值与样品浓度呈良好的线性关系，且R2大于0.99，标准曲线见图6。经计算，Cut-off值为0.097，根据Cut-off值确定该方法的检测下限为2.5 U，即灵敏度为2.5 U。

图6 标准曲线Fig.6 Standard curve of ELISA

2.5.2特异性 用建立的方法对14份样本进行检测，重组S蛋白、重组RBD蛋白、SARS-CoV-2武汉株灭活病毒液、SARS-CoV-2灭活疫苗半成品4份样本为阳性，其余10份样本检测结果为阴性，均与已知背景相符，表明建立的双抗体夹心ELISA法具有良好的特异性。

2.5.3准确性 将标准品分别稀释至高、中、低3个不同浓度进行检测，S蛋白抗原加样回收率在92.10%~111.58%之间，见表3。表明建立的方法准确性较高。

表3 准确性验证结果Tab.3 Validation for accuracy

2.6方法的初步应用 用建立的方法对10份疫苗生产工艺不同阶段样本进行检测，与中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所新冠疫苗定量检测方法的符合率在94.2%～109.0%之间，见表4。表明该方法可应用于疫苗生产工艺中样本的定量检测。

表4 符合率验证结果Tab.4 Validation for coincidence rate

3 讨论

SARS-CoV-2的感染传播给世界公共卫生安全造成了极大威胁，也给全球各国造成极大的经济损失和社会影响［12］，截至目前，Delta、Lambda等突变株的传播仍威胁着人类健康［13］。疫苗是目前控制全球疫情蔓延最经济、有效的手段。据世界卫生组织报道，疫情至今共有近200种新冠疫苗处于研发阶段，并已批准10余种疫苗在1个或多个地区上市。这些疫苗基本均以S蛋白或RBD为靶点，因此，建立针对S蛋白的定量检测体系对于疫苗定量具有重要意义。

本研究通过杂交瘤技术筛选制备了18株S蛋白特异性单抗，并通过7B10A2细胞株制备了腹水单抗，建立了定量检测S蛋白的双抗体夹心ELISA方法。该方法可特异性检测新冠病毒S蛋白，在2.5~160 U范围内，R2大于0.99，线性良好，检测灵敏度可达1.25 U，且样品检测回收率在92.10%~111.58%之间，检测来自疫苗生产工艺的已知S蛋白抗原含量样本符合率在94.2%～109.0%之间。表明该方法可对灭活疫苗生产工艺中的样本准确定量，且该方法可特异性检测新冠病毒RBD蛋白，有望应用于重组疫苗中RBD蛋白抗原含量测定。

本研究采用有限稀释法进行单克隆筛选，试验周期长，操作繁琐，且易造成阳性细胞株丢失。目前，已有单个B细胞分选技术以及流式细胞术进行分选，可快速筛选出阳性细胞株，且不易造成阳性细胞株丢失，可有效提高筛选效率。另外，杂交瘤细胞制备单抗的方法较为成熟，但存在制备抗体所需时间较长，单抗的抗性易丢失等问题［14］，目前已开发出噬菌体抗体库技术、基因工程抗体技术等多种抗体制备平台，可供比较选择。

综上所述，本研究通过制备单抗建立了简便、快速、低成本的S蛋白定量检测双抗体夹心ELISA方法，有望应用于新冠病毒灭活疫苗中S蛋白含量和重组疫苗中RBD蛋白含量检测。但随着疫情传播，多种变异毒株相继出现，给疫苗的保护性带来了挑战，因此，开发对多种变异毒株均具有保护作用的广谱疫苗成为疫情防控的关键。近期的一项研究表明［15］，基于多种冠状病毒共同存在的RBD开发纳米疫苗，可促使猴体产生针对多种变异株及其他冠状病毒的中和抗体，从而达到100%的保护效果。同时，新的研究表明［16］，mRNA疫苗可对包括突变株在内的新冠病毒产生长期保护效力，这为开发应对多种突变株的“广谱”新冠病毒疫苗带来了希望。通过进一步的验证和完善，希望“全能疫苗”能够有效控制疫情的传播。