流感疫苗神经氨酸酶活性荧光底物检测法的建立及验证

邓涛，张家友，刘京，吕传硕，杨晓明

1.国家联合疫苗工程技术研究中心，湖北武汉 430207；

2.武汉生物制品研究所有限责任公司，湖北武汉 430207；

3.中国生物技术股份有限公司，北京 100029

流感是由流感病毒引起的一种急性呼吸道疾病，全球每年约有500万感染病例及25万～64万死亡病例［1］，接种疫苗是预防流感最有效的方法［2］。流感疫苗主要抗原包括血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA），这两种抗原在人和动物体内均能诱导保护性免疫反应［3-4］。

NA是流感病毒包膜上的两种糖蛋白之一，具有切割唾液酸的酶活性，在病毒复制周期中发挥关键作用。NA抗原有助于提高疫苗效力，其特异性抗体可对疾病产生抵抗作用［5-6］。研究表明，无论是自然感染还是免疫接种产生的NA特异性抗体均具有独立的保护作用［7-8］。在临床前研究中，用NA抗原免疫动物可抵抗流感病毒致死剂量的攻击［9-12］；另有临床前研究表明，NA特异性免疫可限制流感病毒在人支气管上皮细胞中的复制，从而保护受试者免受流感病毒感染［13-14］。与HA比较，NA可提供更广泛的交叉保护作用，许多NA特异性抗体能够结合至相应亚型的保守表位上，从而保护机体免受异源病毒攻击［8，15］。流感疫苗在生产过程中，使NA和HA的含量达到天然流感病毒包膜上的比例，才能够诱导一种平衡反应，从而更好地诱导免疫反应［16］。HA可通过单向免疫扩散试验（single radial immunodiffusion，SRID）进行定量检测［17］，但目前尚无用于检测NA的统一标准和方法，这也成为制约流感疫苗质量评价的瓶颈之一。NA的酶活性（1个酶活性单位定义为在37℃，pH 7.5环境下，每分钟催化1 nmol酶底物所需的酶量）是反映其天然结构的较好指标，与免疫原性密切相关，因此NA的酶活性在疫苗研发和质量控制中具有重要意义。本实验旨在建立一种荧光底物法用于NA酶活性的检测，并进行方法的验证，以期为流感疫苗的生产提供一种可靠的质控方法。

1 材料与方法

1.1样品及参考品 MDCK细胞基质四价流感裂解疫苗（批号：202012005）及该批次疫苗上游半成品（包括H1N1、H3N2、BV、BY各单价的病毒收获液、纯化液和原液）均由武汉生物制品研究所有限责任公司（简称武汉公司）病毒性疫苗研究二室提供；鸡胚基质四价流感裂解疫苗（批号：Z201912001）由武汉公司流感疫苗室提供；重组NA蛋白参考品（货号：40017VNAHC1）购自北京义翘神州科技股份有限公司。

1.2主要试剂及仪器 唾液酸类似物4-MUNANA（货号：M8639）购自美国Sigma公司；2-（N-吗啡啉）乙磺酸［2-（N-morpholino）ethanesulfonic acid，MES）］（货号：30123760）及CaCl2（货号：100-05817）购自国药集团化学试剂有限公司；黑色不透明96孔板（货号：F605034）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；多功能微孔板检测仪（型号：EnSight）购自德国Perkinelmer公司。

1.3溶液配制 酶底物母液：用超纯水将4-MUNANA溶解至2 mmol/L，避光配制，-20℃避光保存，避免反复冻融；MES缓冲液：用超纯水将MES和CaCl2分别稀释至终浓度32.5和4 mmol/L，用NaOH调节pH，经0.22μm针头滤器过滤，4℃保存。

1.4方法的建立 用无菌PBS（pH 7.2）将待检样品进行稀释，加入96孔板，50μL/孔；酶活力依赖于反应体系酸碱度，NA与4-MUNANA的酶促反应通常使用MES溶液作为缓冲液［18］，因此用MES缓冲液稀释酶底物母液，避光配制且现配现用，加入96孔板，50μL/孔，振荡混匀，于一定温度下反应适当时间；以365 nm作为激发光，测定445 nm的发射光的荧光强度，即相对荧光值（relative fluorescence units，RFUs）。

1.5方法的优化

1.5.1酶底物浓度的确定 将4种流感病毒单价原液进行100倍稀释，以PBS作为对照；用pH为7.5的MES缓冲液将酶底物母液分别稀释为10、20、30、40、50μmol/L。加入96孔板后，于37℃反应40 min，测定荧光强度，选择荧光强度高于3倍噪音且酶反应未达饱和的浓度作为酶底物最佳浓度。

1.5.2反应时间的确定 将4种流感病毒单价原液进行100倍稀释，以PBS作为对照；用pH为7.5的MES缓冲液将酶底物母液稀释至最佳浓度，加入96孔板后，于37℃反应，每2 min测定1次荧光强度至90 min。以反应时间为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制反应进程曲线。

1.5.3缓冲液pH的确定 将4种流感病毒单价原液进行100倍稀释，以PBS作为对照；MES缓冲液pH分别调节为4.5、5.5、6.5、7.5、8.5和9.5，用MES缓冲液将酶底物母液稀释至最佳浓度，加入96孔板后，于37℃反应40 min，测定荧光强度。

1.5.4反应温度的确定 将4种流感病毒单价原液进行100倍稀释，以PBS作为对照；用pH为7.5的MES缓冲液将酶底物母液稀释至最佳浓度，分别于4、25、37和45℃反应40 min，测定荧光强度。

1.6方法的验证

1.6.1线性范围 将重组NA蛋白参考品用无菌PBS（pH 7.2）稀释为2 000、1 000、500、250、125、62.5 U/L，每个样品平行设3个孔，采用1.5项优化的方法测定荧光强度，试验重复3次，以参考品浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.6.2准确度 将重组NA蛋白参考品用无菌PBS（pH 7.2）稀释为高（1 600 U/L）、中（800 U/L）、低（400 U/L）3个浓度，每个样品平行设8个孔，采用1.5项优化的方法测定荧光强度，试验重复2次，计算样品回收率。

1.6.3精密度 将重组NA蛋白参考品用无菌PBS（pH 7.2）稀释为高（1 600 U/L）、中（800 U/L）、低（400 U/L）3个浓度，每个样品平行设6个孔，于2个不同时间采用1.5项优化的方法测定荧光强度，计算2个时间点共12次检测结果的均数±标准差（±s）及变异系数（CV）。

1.7方法的应用 将H1N1、H3N2、BV、BY相应的病毒收获液、纯化液和原液进行总蛋白定量后，分别稀释至线性范围的相同蛋白浓度。通过相同方法对MDCK细胞基质和鸡胚基质的四价流感裂解疫苗进行稀释，分别以未接种病毒的MDCK细胞悬液和鸡胚尿囊液作为相应的阴性对照。采用优化的方法对样品进行检测。

2 结果

2.1方法的优化

2.1.1最佳酶底物浓度 4种单价流感病毒原液的荧光强度随酶底物浓度增加而升高，该试验噪音即本底约为700，见图1。信号高于3倍噪音且酶反应未达饱和的底物浓度为20μmol/L，即为酶底物最佳浓度。

图1 不同浓度酶底物的荧光强度Fig.1 Fluorescent strengths of enzyme substrate at various concentrations

2.1.2最佳反应时间 4种单价流感病毒原液在初始阶段急剧上升，随着时间的延长，曲线趋于平坦，反应速度降低（曲线斜率为酶促反应初速度），60 min后，荧光信号开始减弱，可能是由于产物增多抑制了酶活性，且出现了逆反应。在30~60 min期间，4种样品的荧光强度基本达到最大值且相对稳定，酶促反应达到饱和，因此选择40 min为最佳反应时间。见图2。

图2 酶促反应进程曲线Fig.2 Progress curves of enzymatic reaction

2.1.3最佳反应缓冲液pH 随着pH的升高，PBS对照组的荧光强度逐渐升高，4种单价流感病毒原液的荧光强度在pH 6.5~8.5较为稳定，因此选择7.5作为缓冲液最佳pH，见图3。

图3 不同pH的荧光强度Fig.3 Fluorescent strengths of samples at various pH values

2.1.4最佳反应温度 4种单价流感病毒原液在4℃时荧光强度较低，25、37和45℃时的荧光强度差异较小，考虑到NA的天然催化环境为机体环境，因此选择37℃作为最佳反应温度，见图4。

图4 不同反应温度的荧光强度Fig.4 Fluorescent strengths of samples at various reaction temperatures

2.2方法的验证

2.2.1线性范围 NA检测标准曲线见图5。重组NA蛋白参考品浓度在62.5~2 000 U/L范围内，与荧光强度呈良好的线性关系，重复检测3次的标准曲线方程分别为y=15.39x+466.33、y=15.68x+155.07、y=15.98x+378.62，R2分别为0.992 7、0.997 0、0.995 1，均＞0.99。

图5 NA检测的标准曲线Fig.5 Standard curve for determination of NA activity

2.2.2准确度 1 600、800、400 U/L 3个浓度参考品的回收率分别为92.60%~106.96%、85.54%~113.11%、87.00%~114.54%，均在85%~115%范围内，表明该方法具有良好的准确度，见表1。

表1 准确度验证结果Tab.1 Verification for accuracy

2.2.3精密度 1 600、800、400 U/L 3个浓度参考品于2个时间点共12次检测结果的CV分别为6.40%、8.25%、6.92%，CV均＜15%，见表2。表明该方法具有良好的精密度。

表2 精密度验证结果Tab.2 Verification for precision

2.3方法的应用 保持总蛋白浓度一致的情况下，H1N1、H3N2、BV和BY 4种型别的流感疫苗半成品在不同阶段（病毒收获液、纯化液和原液）NA活性逐渐降低，H1N1、H3N2、BV和BY原液中的NA酶活性分别为20 440.06、23 010.87、19 546.90、18 714.87 U/L，其中H3N2原液NA活性高于其他3种原液，见图6。表明在疫苗生产过程中损失了部分有活性的NA。细胞基质及鸡胚基质四价流感裂解疫苗的NA活性分别为61 585.82和69 583.51 U/L（相应阴性对照分别为116.58和111.44 U/L），前者低于后者。

图6 四价流感裂解疫苗半成品的NA活性Fig.6 NA activity of final bulk of tetravalent influenza split vaccine

3 讨论

NA含量测定的最简单方法是将疫苗样品进行SDS-PAGE分析，再使用相同毒株/亚型的NA特异型抗体进行Western blot检测，通过扫描灰度对NA进行半定量［19］。该方法可用于比较不同厂家及不同批次疫苗制剂的NA相对含量，但不能评估NA的结构完整性，也不能精确定量。另有一种方法是采用毒株/亚型特异性抗体的ELISA法直接定量NA，可用于测量正确折叠的NA蛋白含量［20］。目前，已开发出基于高效液相色谱和质谱的方法，但操作复杂，不能确定所分析NA是否具有完整的蛋白结构［21］。仅有四聚体形式的NA才具有较强的唾液酸酶活性，而酶活性与免疫原性密切相关，因此酶活性检测在分析疫苗NA的质量方面具有重要意义［22］。

本研究采用唾液酸类似物4-MUNANA作为酶底物，特异性与NA反应并产生荧光物质，即四甲基伞形酮（4-methylumbelliferone，4-MU），通过检测4-MU的荧光强度来评价NA活性。考虑到酶促反应影响因素主要包括底物浓度、反应时间、缓冲液pH及反应温度，因此应用细胞基质四价流感疫苗各单价原液作为样品，对这4种反应条件进行优化，得到最佳反应条件为：酶底物浓度为20μmol/L，反应时间为40 min，反应缓冲液pH为7.5，反应温度为37℃，该结果与相关文献报道基本相符［18］。本研究采用已知酶活的重组NA蛋白作为参考品，对优化的方法进行方法验证，结果显示，重组NA蛋白参考品浓度在62.5~2 000 U/L范围内，与荧光强度呈良好线性关系，R2均＞0.99。采用优化的方法对细胞基质四价流感疫苗各阶段工艺过程的样品进行分析显示，疫苗制剂中的NA活性在不同阶段产生不同程度的损失，其原因可能是疫苗制剂在超滤浓缩、病毒裂解及层析纯化等程序中损伤NA的四聚体结构，从而影响其活性。不同基质流感疫苗中NA活性远超过相应对照品，活性较高。

综上所述，本研究建立了检测NA活性的荧光底物法，该方法具有良好的准确度和精密度，可用于不同基质生产的流感疫苗及不同生产阶段的半成品中具有酶活性NA的定量检测，为流感疫苗的质控提供了一种简便实用的方法。