S AR S-C oV-2抗原检测用样品盘的建立及其在胶体金测试卡研发和质量评估中的应用

施金荣，周志军，程小玲，杨爽，李茜，罗敏，石艳红，李策生，李陶敬

1.武汉生物制品研究所有限责任公司，湖北武汉 430207；

2.国药集团武汉血液制品有限公司科研开发部，湖北武汉 430207；

3.北京天坛生物制品股份有限公司研发中心，北京 100024

新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARSCoV-2）引起的急性感染性肺炎。COVID-19疫情暴发后，我国迅速研制了SARS-CoV-2的核酸检测试剂及其抗体快速检测试剂（胶体金测试卡），均已批准用于大规模检测［1-2］。核酸检测法研发速度快、灵敏度高，在前期疫情防控工作中发挥了重要作用［3-4］。与抗体胶体金测试卡比较，抗原胶体金测试卡可更早识别SARS-CoV-2感染，更利于疫情防控［5-6］。抗原胶体金测试卡的临床检测灵敏度与核酸技术相当，应对突变更可靠，碱基点突变不会马上导致氨基酸突变，个别氨基酸突变不会导致抗原改变；SARS-CoV-2抗原稳定性远高于RNA，不易降解，不会受假阴性假阳性困扰；检测简单易行，无需任何专业设备设施，可用于家庭自检。抗原胶体金测试卡与核酸检测联合使用，优势互补，可大幅提高检出率［7-10］。

目前，全球COVID-19疫情仍较严峻，SARSCoV-2抗原胶体金测试卡缺口较大，多个厂家处于试剂研发和注册申报过程中。由于阳性样品不易获取，多数厂家在研发过程中无法通过大量样品检测来评估胶体金测试卡质量。武汉生物制品研究所有限责任公司（简称武汉公司）研发的SARS-CoV-2灭活疫苗具有良好的安全性和有效性，该疫苗原液为2次灭活2步纯化的完整病毒颗粒，未添加氢氧化铝佐剂；灭活的SARS-CoV-2培养液为病毒收获液经1次灭活的上清，包含完整病毒、病毒碎片和细胞碎片，更接近自然感染条件下病毒存在状态。本实验选用经2次灭活的SARS-CoV-2疫苗原液、经1次灭活的SARS-CoV-2培养液及重组SARS-CoV-2 N蛋白建立SARS-CoV-2抗原检测用阳性样品盘，用于胶体金抗原测试卡的抗原检测灵敏度评价。同时以部分呼吸道病毒和细菌疫苗原液作为阴性对照，建立SARS-CoV-2抗原检测用阴性样品盘。阴阳性样品盘结合用于SARS-CoV-2抗原测试卡的研发和质量评估。现将评估结果报道如下。

1 材料与方法

1.1S A R S-C o V-2抗原胶体金测试卡 分别由湖北工业大学免疫学与生物医药研究团队［共8批22个亚批：20200810（重组S蛋白单抗）、2020082911～2020-082914（重组S蛋白单抗）、2020082921～2020082927（重组S蛋白单抗）、2020092301和2020092302（重组N和S蛋白单抗）、2021011201～2021011203（天然N蛋白单抗）、20200201和20200202（天然N蛋白单抗）、202100310（天然N蛋白单抗）、N8067210430和N8067210725（天然N蛋白单抗）］、国为生物科技泰州有限公司［批号：202007308a（重组S蛋白单抗）］、杭州隆基生物技术有限公司［科研批号：S20-2007081～202007086（重组S和N蛋白单抗各3批），生产批号：S2021（重组N蛋白单抗），已获欧盟CE认证］、武汉汇海医药科技发展有限公司［批号：2020-0714（重组N蛋白单抗），已获欧盟CE认证］、广州和信健康科技有限公司［批号：20201205（重组N蛋白单抗），已获欧盟CE认证］、深圳市惠安生物科技有限公司［批号：210101（重组N蛋白单抗），已获欧盟CE认证］、长沙三诺生物传感股份有限公司［批号：20210201（重组N蛋白单抗），已获欧盟CE认证］提供，分别编号为厂家A～G。

1.2S A R S-C o V-2核酸检测相关试剂 RNA提取试剂QIAamp Viral RNA Mini Kit（批号：166012741）购自德国QIAGEN GmbH公司；SARS-CoV-2核酸检测试剂盒（荧光PCR法）（批号：nCOV20210302）购自上海捷诺生物科技有限公司。

1.3S A R S-C o V-2抗原检测用样品盘的建立

1.3.1阴性样本盘 包括流感病毒疫苗H1、H3、BY、BV 4种病毒血清型原液（血凝素含量分别为685、246、207、353μg/mL）、脊髓灰质炎灭活疫苗（inactivated poliovirus，IPV）的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3种病毒血清型原液（抗原含量分别为3 120、436、2 223 DU/mL）、肠道病毒71型（enterovirus，EV71）灭活疫苗（Vero细胞）原液（抗原含量为18 047 U/mL）、乙脑减毒活疫苗原液（病毒滴度为6.4 lgCCID50/mL）、白喉疫苗原液（蛋白氮含量为0.060%）、百日咳疫苗原液（抗原含量为130.1μg PN/mL）、破伤风疫苗原液（蛋白氮含量为0.042%）共12个非SARS-CoV-2灭活疫苗原液（均由武汉公司质保部提供）及黏蛋白（购自上海源叶生物科技有限公司，用1.4 mL注射用水溶解26 mg黏蛋白，获得饱和溶液）。

1.3.2阳性样本盘 包括重组SARS-CoV-2 N蛋白（批号：618-092320-B01，规格1 mg，10倍稀释至1 pg/mL）、1批灭活SARS-CoV-2培养液S1（病毒滴度为7.2 lgCCID50/mL）及2批SARS-CoV-2灭活疫苗原液（B1和B2批，抗原含量分别为3 333和3 659 WU/mL；B1批对应灭活SARS-CoV-2培养液滴度为6.9 lgCCID50/mL，B2批对应灭活SARS-CoV-2培养液为S1）。重组SARS-CoV-2 N蛋白购自武汉普健生物科技有限公司，其他样品均由武汉公司质保部提供。

1.4胶体金测试卡检测及结果判定 抗原胶体金测试卡检测为常规双抗体夹心法，反应时间为15~20 min［11］。C线和T线均有显色条带，则判定为阳性；若C线有显色条带，T线无显色条带，则判定为阴性；若C线、T线均无显色条带，或仅有T线显色，则表明试纸已失效，结果无效。

1.5核酸检测及结果判定 核酸检测方法参考文献［12］。TEXAS RED通道为开放阅读编码框（ORF1ab），FAM通道为核壳蛋白（N）基因，两者Ct＜37时判为阳性，无Ct或≥37时判为阴性；内部质控Cy5的Ct＜35时判为阳性，无Ct或≥35时判为阴性；同一份样本的ORF1ab和N同时判为阳性，则该样品判为阳性，若仅有1个通道为阳性，则需复试，复试仍仅有1个通道为阳性，则判为阳性。

1.6阳性样品盘在S A R S-C o V-2抗原胶体金测试卡研发中的应用

1.6.1对4个厂家早期研发的SARS-CoV-2抗原胶体金测试卡的阳性评估 取厂家A（批号：20200810，编号9）、B（批号：202007308a，编号7）、C（批号：S202007081～202007086，编号1~6）、D（批号：20200714，编号8）共9批SARS-CoV-2抗原胶体金测试卡，对SARS-CoV-2灭活疫苗原液B1批进行检测。厂家A需将样品进行20倍稀释，厂家B和D均进行10倍稀释，厂家C进行2倍稀释，按相应说明书要求进行操作。

1.6.2厂家A SARS-CoV-2抗原胶体金测试卡研发的全程检测 将SARS-CoV-2灭活疫苗原液B1用厂家A提供的裂解液进行1∶10稀释，充分裂解病毒后，依次稀释至1∶102~1∶104，采用厂家A的6批19个亚批（2020082911～2020082914、2020082921～2020082927、2020092301、2020092302、2021011201～2021011203、20210201～20200202、20210310）的胶体金测试卡进行检测。观察C线和T线的显色情况，以能观察到阳性结果的最高稀释度作为该测试卡的最低检测限，即灵敏度。

1.7S A R S-C o V-2抗原检测用样品盘在胶体金测试卡质量评估中的应用

1.7.1阴性样品盘对SARS-CoV-2抗原胶体金测试卡特异性的检测 将SARS-CoV-2抗原检测用阴性样品盘用厂家A、C、E、F、G提供的裂解液进行10倍稀释，采用相应厂家的胶体金测试卡（厂家A：N806-7210430和N8067210725，厂家C：S2021，厂家E：20200714，厂家F：210101，厂家G：20210201）进行检测，并以相应裂解液作为阴性对照。

1.7.2阳性样品盘对SARS-CoV-2抗原胶体金测试卡灵敏度的检测

1.7.2.1SARS-CoV-2灭活疫苗原液B2 将SARSCoV-2灭活疫苗原液B2用厂家A、C、E、F、G提供的裂解液进行1∶10稀释，充分裂解病毒，再依次稀释为1∶102~1∶106，用相应厂家的胶体金测试卡（批号同1.7.1项）进行检测；以出现阳性结果的最高10倍稀释度为起点，再进行2倍系列稀释或1~5倍稀释，进行再次检测，观察C线和T线的显色情况，以能观察到阳性结果的最高稀释度作为该测试卡的最低检测限。

1.7.2.2灭活SARS-CoV-2培养液S1 按1.7.2.1项方法检测厂家A、C、E、F、G的6批抗原胶体金测试卡（批号同1.7.1项）对灭活的SARS-CoV-2培养液S1的灵敏度，充分裂解病毒后，灭活SARS-CoV-2培养液S1进行10倍系列稀释的稀释度为1∶102~1∶107。1.7.2.3重组SARS-CoV-2 N蛋白 按1.7.2.1项方法检测厂家A、C、E、F、G的6批抗原胶体金测试卡（批号同1.7.1项）对重组SARS-CoV-2 N蛋白的灵敏度，充分裂解病毒后，重组SARS-CoV-2 N蛋白的浓度为1~10 pg/mL，不再进行稀释。

1.8核酸检测试剂对灭活的S A R S-C o V-2培养物S1灵敏度的评价 将灭活SARS-CoV-2培养物S1用生理盐水进行10倍系列稀释，稀释度为1∶10~1∶1010。用RNA提取试剂提取RNA，通过核酸检测试剂盒进行扩增检测，以能观察到阳性结果的最高稀释度作为核酸检测试剂的灵敏度，并将该结果与厂家A的N8067210430批胶体金测试卡检测结果进行比较。

2 结果

2.1阳性样品盘在S A R S-C o V-2抗原胶体金测试卡研发中的应用

2.1.1对4个厂家早期研发的SARS-CoV-2抗原胶体金测试卡的阳性评估 厂家A的9号、厂家B的7号及厂家C的1、2、6号样品均为阴性（重组S蛋白单抗），厂家C的3、4、5号为弱阳性（重组N蛋白单抗），表明N蛋白为检测SARS-CoV-2抗原的主要位点，需使用针对N蛋白单抗进行后续优化。厂家D的8号为强阳性（重组N蛋白单抗），T线阳性颜色较深，后期作为阳性对照测试卡用于厂家A的研发。见图1。

图1 4个厂家的胶体金测试卡检测SARS-CoV-2灭活疫苗原液B1的结果Fig.1 Determination of bulk B1 of inactivated SARS-CoV-2 vaccine by colloidal gold test cassettes from four manufacturers

2.1.2厂家A SARS-CoV-2抗原胶体金测试卡研发的全程检测 厂家A早期针对SARS-CoV-2 S蛋白单抗制备的胶体金测试卡，即2020082911~20200-82914、2020082921~2020082927、2020092302批样品均为阴性。后续改为针对SARS-CoV-2 N蛋白单抗制备胶体金测试卡，其中2020092301批为阳性，检测限为1∶10；2021011201~2021011203和2021-0201~20200202批均为阳性，检测限均为1∶103；20210310批检测结果为阳性，检测限为1∶2×103，进一步提高了灵敏度。

2.2S A R S-C o V-2抗原检测用样品盘在胶体金测试卡质量评估中的应用

2.2.1阴性样品盘对SARS-CoV-2抗原胶体金测试卡特异性的检测 厂家A、C、E、F、G的SARS-CoV-2抗原胶体金测试卡T线均未显色，仅C线显色，检测结果均有效，为阴性（图略）。

2.2.2阳性样品盘对SARS-CoV-2抗原胶体金测试卡灵敏度的检测 N8067210430、N8067210725、S2021、20200714、F210101、20210201批胶体金测试卡对SARSCoV-2灭活疫苗原液B2的检测限分别为1∶2×103（±）、1∶106（±）、1∶104（+）、1∶4×103（±）、1∶2×103（+）、1∶2×103（±），对灭活SARS-CoV-2培养液S1的检测限分别为1∶5×105（+）、1∶2×107（±）、1∶106（+）、1∶2×105（±）、1∶105（+）、1∶104（+），其中±表示显色线条较浅，需仔细辨认；+表示显色线条较深，极易辨认。对重组SARS-CoV-2 N蛋白的检测限分别为5 ng/mL及100、10、10、10、10 pg/mL。见图2~图4（仅呈现部分结果）。其中厂家A的N80672-10725批的灵敏度得到较大提高。

图2 SARS-CoV-2灭活疫苗原液B2对5个厂家胶体金测试卡灵敏度的检测结果Fig.2 Sensitivity test results of bulk B2 of inactivated SARS-CoV-2 by colloidal gold test cassettes from five manufacturers

图4 重组SARS-CoV-2 N蛋白对5个厂家胶体金测试卡灵敏度的检测结果Fig.4 Sensitivity test results of recombinant N protein of SARS-CoV-2 by colloidal gold test cassettes from five manufacturers

A：厂家A批号N8067210725（1～5：稀释度分别为1∶104、1∶105、1∶106、1∶107、1∶2×107）；B：厂家A批号N8067210430（1～4：稀释度分别为1∶2×105、1∶3×105、1∶4×105、1∶5×105）；C：厂家C（1～3：稀释度分别为1∶105、1∶106、1∶107）；D：厂家F（1～5：稀释度分别为1∶104、1∶105、1∶2×105、1∶4×105、1∶8×105）；E：厂家E（1～4：稀释度分别为1∶104、1∶105、1∶2×105、1∶4×105）；F：厂家G（1～3：稀释度分别为1∶104、1∶105、1∶2×105）。

2.3核酸检测试剂对灭活S A R S-C o V-2培养物S1灵敏度的评价 灭活SARS-CoV-2培养物S1稀释至1∶107时，核酸检测为弱阳性，稀释至1∶108后为阴性，确定检测限为1×107，见表1。通过与厂家A的N8067210430批的抗原胶体金检测卡灵敏度（1∶5×108）比较表明，胶体金检测卡的灵敏度可达到与核酸检测试剂相当水平。

表1 不同浓度灭活SARS-CoV-2培养物S1的核酸检测情况Tab.1 Nucleic acid detection of inactivated SARS-CoV-2 culture S1 at various concentrations

3 讨论

在SARS-CoV-2抗原胶体金测试卡研发早期，研发单位选用针对SARS-CoV-2 S蛋白的单抗进行研发，其中厂家A针对真核细胞重组表达的S蛋白不同位点单抗进行了多个组合及大量筛选，对重组S蛋白的检测灵敏度达20 pg/mL，但用其检测SARS-CoV-2灭活疫苗原液，结果却为阴性。因此，厂家A改为针对重组N蛋白单抗进行研发，用其检测SARS-CoV-2灭活疫苗原液结果为阳性，经筛选单抗、鉴定试纸配对、调整试纸宽度和裂解液等方面的调整，检测灵敏度提高至1∶106。厂家C科研批（编号1~6）6组抗原测试卡涵盖N和S蛋白不同单抗的组合，通过对SARS-CoV-2灭活疫苗原液的检测，确定应以N蛋白为研发目标，灵敏度达1∶104。分析上述结果的原因是病毒的N蛋白表达量比S蛋白高约10倍，病毒破裂后释放的N蛋白数量远高于S蛋白，因此多个厂家均选择N蛋白作为研发目标。

为比较重组SARS-CoV-2 N蛋白与真病毒N蛋白的差异，本实验检测了5家胶体金测试卡对重组N蛋白的灵敏度，检测结果与病毒培养液的结果无对应性，该结果与相关文献报道一致［13-14］，可能是由于重组蛋白与真病毒N蛋白的构象存在较大差异导致的。厂家A制备的胶体金测试卡对重组N蛋白检测灵敏度仅为100 pg/mL，对灭活SARS-CoV-2培养液S1的灵敏度高达1∶2×107；厂家G对重组N蛋白的灵敏度较高（10 pg/mL），对灭活SARS-CoV-2培养液S1的灵敏度较低（1∶104）；厂家C对重组N蛋白（灭活SARS-CoV-2培养液10 pg/mL）、B2（1∶104）和S1（1∶106）的灵敏度均最高。差异原因可能为厂家A选用的重组N蛋白单抗是针对游离的真病毒N蛋白构象，厂家G选用的是针对重组N蛋白特异构象，厂家C选用的是针对N蛋白保守区的单抗。因此，厂家若以重组N蛋白作为产品研发的检测标的，虽检测灵敏度较高，但对针病毒培养物的检测结果不佳，会产生误导，因此仅可作为企业质控品，不能代替真病毒作为研发检测标的。SARS-CoV-2灭活疫苗原液需经2次灭活和2次层析纯化，以去除游离蛋白颗粒，留下的主要是完整的病毒颗粒。经1次灭活的SARS-CoV-2培养液最接近人体感染状态，检测结果可信度较高。采用5个厂家胶体金测试卡检测灭活SARS-CoV-2培养液S1，结果表明，各厂家的胶体金测试卡灵敏度差异较大，仅有2家的灵敏度较高，厂家A最高，厂家C次之，其他厂家的灵敏度有待提升。5个厂家的胶体金测试卡对阴性样品盘的检测结果均为阴性，表明其对常见呼吸道病毒和细菌未发生交叉反应，但并不能完全代表呼吸道和消化道的真实环境，在转化为唾液检测时，部分厂家出现假阳性问题，其原因可能是部分厂家为了提高测试卡的灵敏度而忽略了稳定性，需要通过寻找更好的单抗组合或大颗粒胶体金标记以解决该问题［15-17］。

另外，本实验采用核酸检测试剂盒对灭活SARSCoV-2培养液S1进行了检测，并将该结果与厂家A的N8067210430批胶体金测试卡检测结果进行了比较，结果显示，两者的灵敏度相当，表明本实验建立的SARS-CoV-2抗原检测用样本盘可用于SARSCoV-2抗原胶体金测试卡的质量评价，为该测试卡的研发提供了技术支持。胶体金测试卡与核酸检测联合应用将大幅提高检出率，提高对COVID-19防控效率。