HPLC法测定开心散中茯苓酸的含量*

张文娓，孟凡佳，宋小雪，闫丽莉，田 明

（黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040）

开心散是国家首批公布的《古代经典名方目录》之一[1]，始载于唐代·孙思邈《备急千金方》卷四十。其功效为安神、补气、利湿化浊，主要用于治疗心气不足，神志不宁，健忘失眠，心怯怔忡等症，是治疗“好忘”的常用方[2]。现代临床常用于治疗老年性痴呆，疗效较好[3]。

开心散组成为人参、茯苓、远志、菖蒲，全方按照君臣佐使原则，配伍严谨，药味精炼，方中茯苓补心安神、健脾益气为君药，现代药理研究表明，茯苓有效成分茯苓酸具有增强免疫力、抗肿瘤以及镇静、降血糖等作用[4,5]。因此，本研究采用HPLC法建立开心散中茯苓酸含量测定方法，旨在为开心散的质量标准后续研究提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试药

Thermo U3000型高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技有限公司）；Elite Hypersil ODS2色谱柱（150mm×4.6mm，5μm，依利特）；AB204-N型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；KQ-500D型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。

茯苓对照药材（S2FK-1C95中国食品药品检定研究院）；甲醇（色谱纯 迪马科技有限公司）；甲醇、乙醚、甲苯、乙酸乙酯、甲酸、H2SO4、石油醚（60～90℃）、三氯甲烷，均为分析纯，天津市永大化学试剂有限公司；开心散（自制），方中四味药材均为道地药材。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：采用Elite Hypersil ODS2色谱柱（4.6×150mm，5μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（79∶21）；检测波长：210nm；流速：1.0mL·min-1，柱温30℃。

1.2.2 对照品溶液的制备 称取减压干燥至恒重的茯苓酸适量，置于25mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得含茯苓酸0.13mg·mL-1的对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备 取自制开心散2.5g，精密称定，依次加入甲醇50、20mL，加热回流两次，每次各1.5h，合并滤液，水浴蒸干，定容至5mL容量瓶中，滤过，取续滤液，即得。

1.2.4 阴性样品溶液的制备 按照处方工艺，制备不含茯苓药材的阴性样品，按照1.2.3项下供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。

2 结果与讨论

2.1 专属性试验考察

将对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液分别放入液相色谱仪中，进样量为10μL，按照1.2.1项下色谱条件进样分析，记录色谱图（图1～3）。

结果显示，供试品溶液与对照品溶液对应峰理论塔板数大于3000，开心散中其他成分对茯苓酸的测定无干扰。

图1 对照品溶液色谱图Fig.1 Chromatography of reference solution

图2 供试品溶液色谱图Fig.2 Solution chromatogram of the sample

图3 阴性样品溶液色谱图Fig.3 Negative Solution Chromatography

2.2 线性关系考察

取茯苓酸对照品溶液，按照1.2.1项下色谱条件进样分析，通过设置不同进样体积，记录峰面积，以含量为横坐标，峰面积为纵坐标，计算线性回归方程为：y=12.758x-0.0175，R2=1.0000，茯苓酸含量在0.13～1.3μg之间有良好的线性关系。

2.3 精密度试验

取自制开心散2.5g，精密称定，按1.2.3项下处理方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件，连续进样6次，计算色谱峰面积的RSD值为0.68%。表明仪器精密度良好。

2.4 重复性试验

平行精密称取6份开心散样品2.5g，按照1.2.3项下处理方法制备供试品溶液，按照1.2.1项下色谱条件，进行含量测定，计算RSD值为3.20%，表明该方法重复性良好。

2.5 稳定性试验

称取开心散2.5g，精密称定，按照1.2.3项下处理方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10、12h进样，记录12h内峰面积，计算RSD值为1.58%。表明供试品溶液在12h内稳定。

2.6 加样回收率试验

精密称取已知茯苓酸含量的开心散6份，每份约1.25g，分别精密加入0.13mg·mL-1的茯苓酸对照品溶液1.5mL，按照1.2.3项下处理方法制备供试品溶液，按照1.2.1项下色谱条件进样分析，计算加样回收率，结果为100.06%（RSD=1.84%），表明回收率良好。结果见表1。

表1 加样回收率试验结果Tab.1 Result of recovery by adding samples

2.7 样品含量测定

按照1.2.3项下方法制备供试品溶液，按照1.2.1项下色谱条件进样分析，计算3批开心散中茯苓酸的含量。3批样品茯苓酸含量分别为0.15、0.12、0.13mg·g-1。由于实验误差的存在，上述样品中茯苓酸含量略有差异，但均在合理波动范围之内。

3 结论

开心散是经典名方制剂，中药成分复杂，而茯苓是开心散复方中起重要作用的成分，因此，本研究选择含量较高的茯苓酸作为指标性成分，采用高效液相色谱法进行含量测定。并对实验方法进行方法学考察，采用该方法对3个平行批次样品中的茯苓酸含量进行了测定，结果表明，该测定方法具有专属性强、灵敏度高、稳定可靠的特点，为开心散有效成分测定、质量控制及临床合理应用提供实验依据和理论支持。