不同产地虫草花总黄酮含量测定与体外抑菌试验研究*

葛 亮，张 莎，姜向东，田树革

（新疆医科大学a.中医学院；b.第五临床医学院，新疆 乌鲁木齐 830000）

虫草花（Cordyceps militaris）隶属子囊菌亚门（Ascomycotina）麦角菌科（Clavicipitaceae）虫草属（Cordyceps），又称虫草子实体、不老草、蛹虫草等[1]。其主要化学成分有黄酮类、多糖类、氨基酸类和核苷酸虫草素等，具有抑菌、抗癌、抗氧化、抗炎、降血糖、补肺益肾等功效[2-10]。但由于虫草花人工培育技术的优化以及市场需求量的增大，虫草花在全国多地均开始种植，其气候条件，环境差异，土壤差别等，使不同产地的虫草花各成分含量存在明显差别。本文以新疆、内蒙、云南、辽宁4个产地的虫草花为研究对象，对其总黄酮的提取工艺进行研究，并对不同产地的总黄酮含量进行了比较，又进行了虫草花总黄酮对变异链球菌的药敏实验，为后期的开发利用提供相关数据。

1 实验部分

1.1 材料和试剂

虫草花：选取新疆、内蒙、云南、辽宁4个产地，均为干品，晾干，粉碎装密封袋，置于干燥器中保存。

葡萄糖对照品（批号：2014506天津市盛奥化学试剂有限公司）；变异链球菌（美国纽约华盛顿州立大学）；脑心浸出液（北京索莱宝科技有限公司）；NaNO2（AR产品批号20200720天津市富宇精细化工有限公司）；Al（NO3）3（AR产品批号20190925成都市科隆化学品有限公司）；NaOH（AR产品批号20190620天津永晟精细化工有限公司）；95%乙醇（AR产品批号20200620天津市富宇精细化工有限公司）；甲醇（AR产品批号20200325天津市富宇精细化工有限公司）；实验室用水为蒸馏水。

1.2 仪器与设备

KQ-5200DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DZF-6021型真空干燥箱（上海精密实验设备有限公司）；HH-S4型恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）；AL204型电子分析天平（德国梅特勒托利多仪器有限公司）：UV2700型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；高速万能粉碎机（天津泰斯达公司）；SW-GJ-2FD型超净工作台（博讯实业有限公司医疗设备）；LD2X-75KBS型全自动电热压力灭菌器（上海申安医疗器械厂）；SPX-100B型生化培养箱（博讯实业有限公司医疗设备）；150mm游标卡尺（上海锡丰标准件有限公司）；100mm培养皿（无锡耐思科技有限公司）；单通道移液枪（大龙兴创实验仪器（北京）有限公司）；低温冰箱（中国Haier公司）。

1.3 溶液配制

1.3.1 样品溶液 精确称取4个不同产地的虫草花粉末5.00g，用60%的乙醇，料液比1∶10，水浴回流提取两次，每次1.5h，待冷却后过滤，合并两次滤液，密封保存于4℃冰箱备用。

1.3.2 对照品溶液 精密称取5.00mg芦丁对照品，用甲醇稀释至50mL容量瓶中，摇匀，获得浓度为0.1mg·mL-1的对照品溶液，存于4℃冰箱保存备用。

1.3.3 显色剂

5%NaNO2的配制 称取5.00g的NaNO2粉末，用蒸馏水稀释至100mL，获得5%的NaNO2溶液，存于4℃冰箱保存备用。

10%Al（NO3）3的配制 称取10.00g的Al（NO3）3粉末，用蒸馏水稀释至100mL，获得10%的Al（NO3）3溶液，存于4℃冰箱保存备用。

4%NaOH的配制 称取4.00g的NaOH粉末，用蒸馏水稀释至100mL，获得4%的NaOH溶液，存于4℃冰箱保存备用。

1.4 实验方法

1.4.1 标准曲线 精密吸取芦丁对照品溶液0.06、0.12、0.24、0.32、0.4mL，置于5个10mL具塞试管中，每管加入5%NaNO20.3mL,充分摇匀，放置6min,加入0.3mL 10%Al（NO3）3，充分混匀，放置6min，最后加入4mL 4%NaOH试液，用蒸馏水补足至刻度，摇匀，混合以芦丁对照品溶液的浓度为横坐标，在510nm处测定相应浓度下测得的吸光度为纵坐标进行线性回归，得到回归方程:A=20.538x+0.0147（R=0.9996），芦丁对照品浓度在0.005～0.45mg·mL-1间线性良好。

1.4.2 虫草花总黄酮提取工艺单因素考察 精密称取2.00g虫草花，分别用按不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25），不同提取时间（0.5、1、1.5、2h），不同提取次数（1、2、3、4次），不同浓度的乙醇（50%、55%、60%、65%）,根据“1.4.1”的实验方法测定总黄酮含量，并计算总黄酮提取率。

1.4.3 虫草花总黄酮提取工艺正交实验优选 在单因素试验的基础上，以总黄酮含量为指标，分别选取料液比（g∶mL）、提取时间（min）、提取次数（次）、乙醇浓度（%）作为考察因素。以虫草花中总黄酮提取率为评价指标，设计L16（44）正交试验探索虫草花总黄酮的最佳提取工艺，正交因素水平表见表1。

表1 正交因素水平表Tab.1 Single factor study of total flavonoids in cordyceps sinensis flowers

1.4.4 不同产地虫草花中总黄酮的含量比较 根据正交试验优化后的虫草花中总黄酮的提取工艺,对4批来自不同产地的虫草花进行总黄酮的提取,并测定其含量的变化。

1.4.5 虫草花中总黄酮体外抑菌实验 采用K-B琼脂扩散法对虫草花总黄酮做对变异链球菌的药敏试验，观察其抑菌效果。

2 结果与讨论

2.1 单因素考察实验结果

2.1.1 料液比考察 虫草花样品在进行预处理后，准确称取虫草花样品2.00g，分别加入料液比（g∶mL）（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）60%乙醇，回提取流1.5h，重复两次，待冷却后合并滤液，由实验结果探讨不同料液比对虫草花总黄酮含量的影响，结果见图1。

图1 料液比对虫草花总黄酮含量的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on total flavonoids content of cordyceps flower

由图1可知，在提取温度、提取时间、提取次数、乙醇浓度一定情况下，随着料液比的升高，总黄酮含量先随之升高后保持不变，、当料液比大于1∶20时，虫草花总黄酮含量不再增加，表明虫草花中的总黄酮已被完全提取。

2.1.2 提取时间考察 虫草花样品在进行预处理后，准确称取虫草花样品2.00g，用60%乙醇，料液比1∶20，回流提取0.5、1、1.5、2h，提取两次，合并滤液，由实验结果探讨不同提取时间对虫草花总黄酮含量的影响，结果见图2。

图2 提取时间对虫草花总黄酮含量的影响Fig.2 Effect of extraction time on total flavonoids content of cordyceps flower

由图2可知，在提取温度、料液比、提取次数、乙醇浓度都一定的情况下，随着提取时间的增加，虫草花总黄酮含量增加，在1.5h后含量几乎保持不变。结果证明，当提取时间大于2h时，虫草花总黄酮含量不再增加，表明虫草花中总黄酮已被完全提取。

2.1.3 提取次数考察 虫草花样品在进行预处理后，准确称取虫草花样品2.0g，用60%乙醇，料液比1∶20，回流提取1.5h，提取1、2、3、4次，分别合并滤液，由实验结果探讨不同提取次数对虫草花总黄酮含量的影响，结果见图3。

图3 提取次数对虫草花总黄酮含量的影响Fig.3 Effects of extraction times on total flavonoids content of cordyceps flower

由图3可知，在提取温度、料液比、提取时间、乙醇浓度都一定的情况下，随着提取次数的增加，虫草花总黄酮含量增加，在提取两次后含量慢慢下降。结果表明，当提取次数大于两次时，虫草花总黄酮含量不再增加，表明虫草花中总黄酮已被完全提取。

2.1.4 乙醇浓度考察 虫草花样品在进行预处理后，准确称取虫草花样品2.0g，分别用浓度为50%、55%、60%、65%的乙醇，料液比（g∶mL）1∶20，回流提取1.5h，提取两次，合并滤液，由实验结果探讨不同乙醇浓度对虫草花总黄酮含量的影响，结果见图4。

图4 乙醇浓度对虫草花总黄酮含量的影响Fig.4 Effects of ethanol concentration on total flavonoids content in cordyceps flower

由图4可知，在提取温度、料液比、提取次数、提取时间都一定的情况下，随着乙醇浓度的增加，虫草花总黄酮含量逐渐增加，当乙醇浓度为60%时，虫草花总黄酮含量几乎保持不变。结果证明，当乙醇浓度大于60%时，虫草花总黄酮含量不再增加，表明虫草花中总黄酮已被完全提取。

2.2 正交实验优选结果

正交实验结果，见表2。

表2 正交实验结果Tab.2 Orthogonal experiment results

由表2可以看出，各因素对虫草花提取影响不同，其顺序为C（提取次数）＞B（提取时间）＞D（乙醇浓度）＞A（料液比）；从实验数据可以得出提取次数对虫草花总黄酮含量影响最大，虫草花总黄酮提取最优结果为A3B3C2D3，即60%乙醇，料液比（g∶mL）1∶20，回流提取两次，每次120min。

在此条件下进行验证试验，以所得最佳工艺条件提取3批同一产地的虫草花样品，测定提取液总黄酮含量分别为4.85、4.92、5.03mg·g-1，平均值为4.93mg·g-1，与预测值较为接近，表明优选的提取工艺稳定可行。

2.3 方法学考察结果

2.3.1 精密度实验 在10mL试管中吸取芦丁对照品溶液6份，每份0.32mL，根据“1.4.1”的实验方法测定吸光度，实验结果见表3。

表3 虫草花总黄酮精密度实验结果Tab.3 Precision test result of total flavonoids in cordyceps flower

由表3可知，RSD为1.41%，符合试验标准，表明实验仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性实验 精确量取0.32mL芦丁对照品溶液，根据“1.4.1”中实验方法操作，每隔15min测定一次吸光度，重复6次，实验结果见表4。

表4 虫草花总黄酮稳定性实验结果Tab.4 Stability test result of total flavonoids in cordyceps flower

由表4可知，其RSD为0.39%，表明芦丁对照品在90min内对照品稳定性良好。

2.3.3 重复性实验 精确称取同一批次样品6份，根据“2.2”中方法获得提取液后精密吸取0.04mL，根据“1.4.1”中实验方法测定吸光度，实验结果见表5。

表5 虫草花总黄酮重复性实验结果Tab.5 Reproducibility test result of total flavonoids in cordyceps flower

由表5可知，其RSD为1.40%，符合实验标准，该方法重复性良好。

2.3.4 回收率实验 精确吸取已知总黄酮含量的虫草花样品与芦丁对照品使其总黄酮含量约为1∶1，按“1.4.1”的实验方法，平行测定吸光度取平均值，根据线性回归方程计算出虫草花总黄酮的含量进而计算加样回收率，实验结果见表6。

表6 虫草花总黄酮加标回收率实验结果Tab.6 Standard recovery result of total flavonoids in cordyceps flower

由表6可知，新疆虫草花总黄酮的平均回收率为99.9%，RSD为1.23%，符合试验标准。

2.4 样品总黄酮含量测定

精确称取4个产地的虫草花2.00g，按照“2.2”的方法获得4个不同产地的虫草花提取液，吸取适量的提取液，按照“1.4.1”中的方法，平行3次测量吸光度取平均值，根据线性回归方程计算出4个不同产地的虫草花中总黄酮含量，结果见表7。

表7 4个产地虫草花总黄酮含量测定结果Tab.7 Determination result of total flavonoids in the flower of Cordyceps from four producing areas

由表7可知，内蒙地区含量最高为5.36mg·g-1,云南地区含量最低为3.98mg·g-1。

2.5 虫草花总黄酮对变异链球菌的抑制实验

2.5.1 菌种复苏与培养 将变异链球菌标准菌种置于装有2mL BHI培养基的有盖试管中，37℃5%CO2培养箱内培养16h，比浊法判断试管变浑浊，说明菌种已复苏。

将培养基在灭菌培养皿倒平板，冷却凝固，用接种针挑取少许复苏后标准菌种划线接种，37℃培养箱培养24h活化。经复苏转种培养后，分别取新传代变异链球菌置于已灭菌的装有2mL培养基的有盖试管中，加入适量葡萄糖溶液，37℃5%CO2培养箱内培养24h后，培养液用脑心浸出液培养基稀释，充分震荡后并用经麦氏比浊管法调整菌液浓度为109CFU·mL-1。

2.5.2 方法与实验 将虫草花黄酮提取物置于水浴锅上蒸干的粉末置于干燥器中保存，取适量虫草花样品稀释至50，25，12.5，4.625，3.125，1.5625，0.78125mg·mL-1。采用K-B琼脂扩散法对虫草花总黄酮提取物做对变异链球菌的药敏试验。将培养好的变异链球菌用移液枪吸取100μL于培养皿上，用灭菌棒铺匀，在琼脂板上均匀打孔，再用移液枪依次加入不同浓度的样品溶液，37℃培养24h以后，记录抑菌圈直径大小判定结果。

判定标准 抑菌圈直径大于20mm以上为高度敏感，10～20mm为中度敏感，10mm以下为不敏感。

2.5.3 药敏实验结果 根据“2.5.2”的方法，实验测定了不同浓度虫草花提取物对变异链球菌的药敏实验，实验结果见图5。

图5 虫草花对变异链球菌的药敏实验Fig.5 Drug susceptibility test of cordyceps sinensis flowers to streptococcus mutans

表8 虫草花总黄酮对变异链球菌的药敏实验结果Tab.8 Drug sensitivity test results of total flavonoids from cordyceps sinensis flowers to Streptococcus mutans

由表8可知，虫草花总黄酮提取物对变异链球菌有明显的抑制作用，虫草花总黄酮提取物在浓度大于50mg·mL-1时，对变异链球菌药敏实验高度敏感，在浓度为6.25～25.00mg·mL-1时中度敏感，在浓度低于3.13mg·mL-1后不敏感。

3 结论

本实验用Al（NO）3-NaNO2-NaOH比色法测定4个不同产地虫草花总黄酮含量。总黄酮的最佳提取工艺为60%乙醇，料液比（g∶mL）1∶20，提取120min，重复两次。实验结果经重复验证，优化提取工艺合理可行。4个不同产地虫草花的总黄酮含量内蒙地区含量最高为5.36mg·g-1，云南地区总黄酮含量最低为3.98mg·g-1。从虫草花总黄酮的抑制实验结果可以看出，虫草花总黄酮对变异链球菌有明显抑制作用，变异链球菌是一种口腔内的细菌，虫草花作为一种真菌类物质，该实验结果为虫草花在食品保健品方面的研究及应用提供了基础数据。