新疆沙枣花抗氧化活性研究及总黄酮测定*

万超超，王东东，郭敬宇，孙 芸

（新疆医科大学 中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011）

沙枣花是胡颓子科胡颓子属植物沙枣（Elaeagnus angustifolia L.）的花，花期在每年5～6月份，沙枣花型较小,长5～7mm,花萼筒钟形,顶端通常4裂,外面呈银白色,内面呈黄色，气味浓郁宜人，有“飘香沙漠的桂花”之称。广泛分布在我国西北地区，生长于半干旱、干旱、半荒漠、荒漠地区，是沙漠里的“宝树”，是天然野生的防风固沙植物[1-3]。《中国沙漠地区药用植物》记载沙枣花具有止咳平喘的功效,可用于治疗慢性支气管炎[4]。沙枣花中芳香油占比为0.2%～0.4%，因此，对于沙枣花中挥发油的研究较多，同时，沙枣花中也含有黄酮、多酚、三萜皂苷以及矿物质元素和微量元素[5-11]。所以，沙枣花具有很好的生物活性，可以止咳平喘，同时沙枣花醇提物还具有提高机体清除氧自由基能力等的活性[12-14]。本实验以沙枣花为原料，评价其抗氧化活性，同时测定了其中的总黄酮、总多酚含量，研究其品质差异可以为沙枣花的利用提供相关理论依据。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

芦丁（批号：A05GB144263上海源叶生物科技有限公司）；没食子酸（批号：MUST-18032801中国食品药品检定研究院）；DPPH，ABTS，购于上海源叶生物科技有限公司；椴树苷（批号：3227，纯度≥98%上海诗丹德标准技术服务有限公司）；NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、Na2CO3、福林酚试剂等均为分析纯；实验用水为自制蒸馏水。

本实验沙枣花采自新疆5个产地，见表1。

表1 沙枣花药材采集时间及地点Tab.1 Collection time and place of Elaeagnus angustifolia flowers

XS-105型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；UV2700型紫外分光光度计（日本岛津公司）；KQ5200DE型数控超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）；HH-S4型数显恒温水浴锅（江苏金坛市医疗仪器厂）；CAMAG REPROSTAR3薄层成像仪（CAMAG，Muttenz，Swit-zerland）。

1.2 实验方法

1.2.1 样品溶液的制备 取各批次沙枣花1.00g，按1∶25加70%乙醇提取，超声45min，滤过，重复此操作两次，将两次滤液合并，即得样品溶液备用。

1.2.2 对照品溶液的制备

芦丁标准液 精密称定芦丁4.93mg，用70%乙醇稀释并定容至25mL，混匀，最终浓度为0.197mg·mL-1，备用。

没食子酸标准液 精密称定没食子酸2.55mg，用70%乙醇稀释并定容至25mL，混匀，最终浓度为0.102mg·mL-1，备用。

1.2.3 DPPH自由基清除率测定 参考文献[15,16]方法，将1.2.1项下得到的沙枣花提取物依次稀释得到浓度为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mg·mL-1的溶液，取2mL样品液和2mL浓度为1×10-4mol·L-1的DPPH溶液于试管混匀，避光反应30min，后在517nm波长处测定吸光度为A1；取2mL样品液与2mL无水乙醇，混匀，后测定吸光度为A2；取2mL蒸馏水与2mL DPPH溶液混匀后测定吸光度为A0。以VC为阳性对照，每个样平行测定3次。按公式（1）计算。

1.2.4 ABTS自由基清除率测定 参考文献[17]方法将1.2.1项下得到的沙枣花提取物依次稀释得到浓度为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mg·mL-1的溶液，取0.2mL样品溶液于试管，向其中加入3.9mL ABTS溶液并混匀，置于暗处反应15min，在734nm处测定吸光度A1；0.2mL样品溶液与3.9mL无水乙醇，混匀，测定吸光度A2；3.9mL ABTS溶液与0.2mL蒸馏水混匀，测定吸光度A0。以VC为阳性对照，每个样品平行测3次。按公式（2）计算

1.2.5 线性关系考察

芦丁线性关系 参考文献[18]方法分别取标准液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL于10mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液0.5mL混匀，放置6min，再加10%Al（NO3）3溶液0.6mL后混匀，放置6min，最后加4%NaOH溶液5mL，蒸馏水定容后于室温下放置12min，以相应试剂为空白对照，在510nm处测定吸光度。以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标进行线性回归，得到线性方程。

没食子酸线性关系 参考文献[19]方法分别取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL标准液于10mL的棕色瓶中，先后加入磷钼钨酸0.5mL和10%Na2CO3溶液1.5mL溶液混匀，以蒸馏水定容后于75℃水浴锅中反应15min，以相应试剂为空白对照，在760nm处测定吸光度。以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标进行线性回归，得到线性方程。

1.2.6 方法学考察 参考文献[15-17]方法取同一标准液6份并测定吸光度，求得相对标准偏差，评价设备精密度；取同一份标准液，每间隔10min测定一次吸光度，测定60min内标准溶液吸光度，计算相对标准偏差，评价方法稳定性；取同一份样品液6份测定吸光度，计算相对标准偏差，评价方法重复性；称取同一份样品6份，各自加入适量的标准品，按相应方法根据标准曲线计算回收率和相对标准偏差，评价方法加样回收率。

1.2.7 样品含量的测定 参考文献[15-17]方法取一定量样品液，根据芦丁和没食子酸的线性关系测定吸光度后带入线性方程，计算提取液中总黄酮和总多酚的浓度，从而求得沙枣花中总黄酮和总多酚含量。

1.2.8 薄层定性鉴别

对照品溶液的制备 精密称定1.02mg椴树苷对照品溶于1mL甲醇，最终浓度为1.02mg·mL-1。

样品溶液的制备 取各批沙枣花粉末约1.00g，加入25mL 70%乙醇提取，超声45min，滤液移入蒸发皿中，于水浴锅上65℃蒸干，得到残渣，加入1mL甲醇溶解，过0.22μm滤膜，即得。

色谱条件 将安徽良辰硅胶板GF254在105℃烘箱中活化15min，存放于干燥器中备用。通过优化进样量，样品（5针，3μL·针-1）和椴树苷对照品（2针，2μL·针-1）分别用linomatic5自动点样仪点样于同一张硅胶板上，带宽6mm，距离TLC板下边缘8mm。用二氯甲烷∶无水乙醇∶甲酸（9∶1∶2）作为展开剂，先于24～26℃，相对湿度为10%的展开缸中预饱和15min，再展开，当流动相展开至距离硅胶板上边缘1cm的位置时取出，晾干，然后用10%硫酸-乙醇溶液显色。于白光下、254、366nm紫外灯下拍照。供试品和标准品在薄层板上相应位置显示相同颜色斑点。

1.2.9 薄层自显影技术分析沙枣花抗氧化活性 吸取5批沙枣花样品溶液3μL和椴树苷对照品2μL，点于GF254硅胶板上，以二氯甲烷∶无水乙醇∶甲酸（9∶1∶2）展开，晾干，以DPPH显色后置于白光下检视。

2 结果与讨论

2.1 沙枣花提取物对DPPH自由基的清除作用

图1为沙枣花提取物对DPPH的清除作用。

图1 沙枣花提取物对DPPH的清除作用Fig.1 Scavenging effect of Elaeagnus angustifolia flower extract on DPPH

由图1可以看出，在2.0～7.0mg·mL-1的系列浓度范围之内，样品浓度不断增大，随之对于自由基的清除率也逐渐增强，表现出不断增长的趋势，有一定的剂量效应关系。同时，也可以发现VC的清除率明显高于样品，但依然表现出了很好的抗氧化效果。

2.2 沙枣花提取物对ABTS自由基的清除作用

由2为沙枣花提取物对ABTS的清除作用。

图2 沙枣花提取物对ABTS的清除作用Fig.2 Scavenging effect of Elaeagnus angustifolia flower extract on ABTS

由图2可以看出，在2.0～7.0mg·mL-1的系列浓度范围之内，样品浓度不断增大，随之对于自由基的清除率也逐渐增强，表现出不断增长的趋势，有一定的剂量效应关系。同时发现，最初VC的清除率明显高于样品，但随着样品浓度的增大，基本与VC持平，表现出了对ABTS自由基良好的清除效果。

2.3 总黄酮、总多酚标准曲线的绘制

表2为线性关系。

表2 线性关系Tab.2 Linear relationship

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度实验 取同一芦丁标准溶液和没食子酸标准溶液各6份，按照1.2.5的方法测吸光度A，得相对标准偏差分别为0.72%和0.97%。说明设备具备良好精密度。

2.4.2 稳定性实验 取同一芦丁标准溶液和没食子酸标准溶液各1份。按照1.2.5的方法在60min内每间隔10min测1次吸光度A，其吸光度在1h内基本稳定，相对标准偏差分别为1.72%和0.68%。

2.4.3 重复性实验 取同一份沙枣花提取液6份，按照1.2.5的方法测定其吸光度A，计算得沙枣花总黄酮和总多酚的吸光度的相对标准偏差分别为1.99%和0.81%。表明该方法重复性良好。

2.4.4 加样回收率实验 取新提取的已知含量的同一份沙枣花样品溶液6份，加入适量的标准品溶液，按照1.2.5的方法测定其吸光度A，计算加样回收率，结果见表3。

表3 加样回收率实验结果Tab.3 Experimental result of sample recovery rate

由表3可知，沙枣花总黄酮、总多酚加样回收率分别为（99.28±1.10）%和（99.44±2.00）%，其相对标准偏差分别为1.11%和1.84%。表明该方法稳定可靠。

2.5 样品的含量测定

表4为新疆不同产地沙枣花总黄酮和总多酚含量测定结果。

表4 新疆不同产地沙枣花总黄酮和总多酚含量（n=3）Tab.4 Contents of total flavonoids and total polyphenols in Elaeagnus angustifolia flowers from different producing areas in Xinjiang（n=3）

由表4可以看出，沙枣花中总黄酮的含量基本差距不大，最高为乌鲁木齐南湖公园批次22.34mg·g-1，最低为昌吉阜康市批次18.29mg·g-1；沙枣花总多酚的含量中，含量最高的为乌鲁木齐鲤鱼山批次30.04mg·g-1,含量最低的为乌鲁木齐植物园批次11.78mg·g-1，另外3个批次差距不大。

2.6 薄层鉴别结果

图3、4是未喷显色剂时在254和366nm下拍摄的图片，图5～7是喷10%硫酸-乙醇显色剂后，在254、366nm和白光下拍摄的图片，结果显示，锻树苷对照品和样品的斑点清晰。

图3 未喷显色剂时254nm下的TLC图Fig.3 TLC at 254nm without spraying developer

图4 未喷显色剂时366nm下的TLC图Fig.4 TLC at 366nm without spraying developer

图5 喷完显色剂时254nm下的TLC图Fig.5 TLC diagram at 254nm after spraying developer

图6 喷完显色剂时366nm下的TLC图Fig.6 TLC diagram at 366nm after spraying developer

图7 喷完显色剂时白光下的TLC图Fig.7 TLC diagram under white light after spraying developer

2.7 薄层自显影技术分析沙枣花抗氧化活性结果

在紫色的背景下，显示亮白色斑点，证明沙枣花具有很好的抗氧化活性[20]，沙枣花供试品中有多个较为明显的亮白色斑点。本实验中椴树苷斑点明显，表明其抗氧化活性很好。但同样可以看出，仍有部分抗氧化活性明显的斑点，目前是未知的成分，在后续的研究中可以进一步确认。

图8 沙枣花提取物薄层生物自显影TLC图Fig.8 TLC diagram of Elaeagnus angustifolia flower extract by thin-layer autoradiography

3 结论

实验表明，沙枣花对DPPH和ABTS自由基均有较好的清除活性；测定其中的总黄酮、总多酚的含量，实验方法学考察结果在允许的误差范围内，表明实验结果可靠。沙枣花总黄酮、总多酚含量存在一定的差异，可能是由于气候、海拔以及光照等自然地理因素的影响。同时实验采用薄层鉴别的方法鉴别出了椴树苷成分，并采用薄层生物自显影的方法对其抗氧化活性进行了评价，表明椴树苷除了有明显抗氧化活性外，还有多个斑点，表明抗氧化效果明显，有待后续进一步研究，这在保健食品、抗氧化功能食品方面为沙枣花的开发利用提供了一定的参考，从而促进沙枣资源的充分利用。