茯苓甘草汤治疗肺动脉高压机制探讨*

马雨婷，司明东，张笑迎，贾毓欣，闫翠环，马东来

河北中医学院河北省中药组方制剂技术创新中心 河北石家庄 050091

肺动脉高压（pulmonary hypertension， PH）作为一种常见的病理生理性、渐进性疾病，具有肺小动脉收缩、肺血管重塑、血栓形等主要病理特征[1]，是由多种原因引起的肺动脉压异常升高的一种病理生理状态[2]，是大多数的心血管和呼吸系统疾病发生发展的关键环节，最终会导致患者右心功能受损甚至死亡，如未进行及时治疗，确诊后平均寿命约2.8年[3-4]。PH机制尚未清晰，起病隐匿，发展缓慢，诊断方式较为复杂，难以尽早确诊治疗，右心导管检查是目前唯一的确诊肺动脉高压的西医检查手段[5]。临床治疗上西药种类繁多，价格昂贵，却不能有效降低PH患者病死率，副作用及不良反应较为明显。PH以活动后气促、疲劳、胸痛、晕厥、干咳、恶心、呕吐、腹胀、水肿等为主要表现，当属中医“肺胀”范畴[6]。“肺胀”病名首见于《黄帝内经》曰：“肺胀者，虚满而喘咳”表明本病病机源于“虚”，《丹溪心法》：“肺胀而咳，或左或右不得眠，此痰夹瘀血碍气而病”，则详细阐述PH的症状、病因，提示肺胀与痰血互结阻碍肺气有关。现代中医家多数认为本病发生根本在于肺、肾、脾、心之脏腑功能虚衰，属本虚标实之证。在本病的发病及演变的过程中，诸因相兼共存，“虚”“痰”“瘀”贯穿于本病始终[7]。中医学者运用中医辨证论治的特色体系，在该病的预防和治疗过程中取得了一定的关注和认可[8-9]。

茯苓甘草汤由茯苓、甘草、生姜和桂枝等四味药组成，始载于张仲景的《伤寒论》。《普济方》：茯苓、甘草之甘，益津液而和营，桂枝、生姜之辛，助阳气而解表。《伤寒附翼》：肺为水母，肺气不化，则水气不行。茯苓为化气之品，故能清水之源；桂枝、生姜，则从辛入肺，使水气通于肺，以行营卫阴阳，则外走肌表而为汗矣，佐甘草以缓之。陈婷婷、周雯等在临床上运用茯苓甘草汤治疗肺动脉高压气虚血瘀证取得了较好的疗效，可明显改善患者肺功能和肺部血液循环[10-11]。范伟赢、王伯章等的研究也表明本方对治疗慢性常压低氧性肺动脉高压具有较好的疗效[12]。茯苓甘草汤治疗PH具有多途径、多环节、多靶点、多组分间协同调节的优点，但其组分多样，系统庞大，目前的深入研究缺乏系统性。

网络药理学的研究方式与中医学的“整体观念”十分契合，本文采用网络药理学探讨茯苓甘草汤治疗肺动脉高压的主要功效物质以及配伍机制和可能的分子作用机制，为深入开展茯苓甘草汤临床合理应用提供科学理论参考。

方 法

1 茯苓甘草汤的化学成分及其靶点预测

在中药系统药理学分析平台（TCMSP）（http://ibtshkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）检索茯苓甘草汤中茯苓、甘草、生姜、桂枝的全部化学成分，并以口服利用度OB≥30%，类药性DL≥0.18为条件筛选出其预测靶点基因。

2 疾病靶点的确定

通 过OMIM数 据 库（http://omim.org/） 以“pulmonary hypertension”为关键词搜集与肺动脉高压疾病相关靶点。

3 药物-化合物-靶点网络的构建

将在TCMSP平台上所得潜在靶点与OMIM数据库所得结果取交集，获得化合物-疾病共同作用靶基因。在Cytoscape 3.7.1软件（http://www.Cytoscape.org/）输入候选化合物和相关疾病靶点数据，生成一个体现药物靶点相互作用的网络图，构建“药物-化合物-靶点”网络，并进行分析。

4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建

利用 Cytoscape 3.7.1软件中Bisogenet 3.0.0插件，物种选择“Homo sapiens”，构建蛋白质相互作用网络，并利用CytoNCA进行拓扑分析，根据Degree centrality（DC）＞61，Betweenness centrality（BC）＞100筛选核心靶点。

5 基因功能分析与富集分析

利用Bioconductor中软件包对共同靶点进行GO分子功能（MF）、生物过程（BP）、细胞组成（CC）和KEGG通路富集分析，保留P≤ 0.05的结果，得到GO柱状图及KEGG信号通路气泡图，最后运用Cytoscape 3.7.1 软件构建共同靶点-信号通路网络图。

6 核心化合物-靶标蛋白分子对接

在TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）数据库获得化合物名称、分子量以及三维结构式，保存为mol2格式。从RSCB PDB数据库（https://www.rcsb.org/）下载血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的3D结构文件。首先利用AutoDock 4.2.6（http:// autodock. Scripps. edu/news/autodock 42.6）将mol2格式的配体（化合物）文件通过加氢，计算电荷，合并非极性氢后保存成pdbqt格式；对蛋白质进行去水、加氢等操作，保存为pdbqt格式文件备用；其后运行AutoDock进行对接，分子对接的Grid box设定为以原配体为中心的周围所有残基，根据每个化合物的最优结合能（affinity）进行排序，研究选取结合能最低的3个活性成分作为茯苓甘草汤治疗肺动脉高压靶点的筛选依据，利用Pymol 2.3.3（https://pymol.org/2/）观察和分析化合物与蛋白对接结果。

结 果

1 活性化合物及靶点基因的筛选

去重后本文共筛选出117个候选化合物，利用Venn 2.1软件筛选出91个化合物-疾病共同作用靶基因，成分-靶点信息见表1。其中有两个共有成分，β-sitosterol（β-谷甾醇）为桂枝生姜共有成分，sitosterol（谷甾醇）为桂枝甘草共有成分。

表1 成分-共同靶点信息

2 成分-靶点网络构建及分析

利用Cytoscape3.7.1将117个化合物共作用于91个相关靶点构建药物-化合物-靶点网络，MOL000276等17个化合物在该数据库中还未有相关的靶点，故而在网络中不予显示。其中紫色为甘草，绿色为生姜，橙色为桂枝，深蓝色为茯苓。甘草作用于靶点的化合物多达88个，平均每个化合物作用于数十个靶点，化合物MOL000098 quercetin（槲皮素）有最多的潜在靶点（66个），其次为MOL000422 kaempferol（山柰酚）（29个）、MOL000354 isorhamnetin（异鼠李素）（13个）。单从作用层次上，提示槲皮素在网络中贡献最大。生姜和桂枝共有成分中的MOL000358 β-sitosterol（β-谷甾醇）也具有较多靶点（16个）。这些数据提示我们，靶点多的化合物很有可能在茯苓甘草汤的药理功能中发挥着较为重要的作用。

图1 药物-化合物-靶点相互作用网络图

3 蛋白质－蛋白质相互作用（PPI）网络的构建

蛋白质—蛋白质相互作用（PPI）网络可以更好的了解各种蛋白质在复合体中的作用。利用 Cytoscape3.7.1软件中Bisogenet插件，构建出靶蛋白之间的网络关系得到PPI网络，见图3，其中包括1990个蛋白，12656条相互关系通道，将1990个蛋白做网络拓扑分析，其中参数包括DC、BC，DC的数值设置为大于61；BC的数值设置为大于100；得出11个靶标蛋白，27条相互通路，排名前6的靶蛋白为EGFR、CTNNB1、UBC、YWHAZ、PRS27A、HSP90AB1。

图3 拓扑分析网络

4 靶点GO与KEGG富集分析

对91个共同靶点进行GO和KEGG富集分析，根据保留P≤0.05的结果，并分别对前20个条目进行可视化分析，得到柱状图和气泡图，其中柱状图纵坐标表示GO名称，横坐标表示富集个数；气泡图纵坐标表示KEGG名称，横坐标表示基因比例。如图5A所示，共同作用靶点在生物过程（BP）中，主要为类固醇激素反应（response to steroid hormone）、酮反应（response to ketone）、对外来生物刺激的反应（response to xenobiotic stimulus）等。如图5B所示，其共同靶点在细胞组成（CC）中主要涉及受体复合物（receptor complex）、膜筏（membrane raft）、膜微结构（membrane microdomain）等。如图5C所示，共同靶点在分子功能（MF）中主要为细胞因子受体结合（cnuclear receptor activity）、磷酸酶结合（transcription factor activity， direct ligand regulated sequencespecific DNA binding）、细胞因子活性（DNA-binding transcription activator activity， RNA polymerase IIspecific）等过程。通过KEGG通路富集分析，其共同靶点主要富集于流体剪切应力和动脉粥样硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、乙型肝炎（Hepatitis B）等相关信号通路上，见图5D。

图4 核心靶点GO与KEGG通路富集图

讨 论

本研究结果分析了茯苓甘草汤4 味中药（甘草、茯苓、生姜、桂枝）的有效活性成分119种，常春藤皂甙元（hederagenin，茯苓）、美迪紫檀素（Medicarpin，甘草）、异鼠李素（isorhamnetin，甘草）、7-甲氧基-2-甲将筛选得到的靶点和通路导入Cytoscape3.7.1软件构建基因-KEGG网络图，如图5所示，红色表示靶点，黄色表示KEGG通路。结果显示邻接节点数目较多的通路有Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、MAPK 信号通路、Human cytomegalovirus infection等，靶点有RAF1、CCND1、MAPK10等。

图5 靶点-通路网络

5 分子对接结果分析

分子对接结果显示，将药材-化合物-靶点网络中度值排序前15个核心活性化合物与VCAM-1和ICAM-1进行分子对接，与VCAM-1结合能最低的化合物分别为shinpterocarpin（结合能为-4.76 kJ/mol）、7-Methoxy-2-methyl isoflavone（结合能为-3.5 kJ/mol）、3’-Methoxyglabridin（结合能为-3.42 kJ/mol），与ICAM-1结合能最低的化合物分 别 为Licoagrocarpin（结合能为-3.46 kJ/mol）、shinpterocarpin（结合能为-2.73 kJ/mol）、β-sitosterol（结合能为-2.63 kJ/mol）。将核心化合物及目前报道的可能具有抗肺动脉高压作用的化学药中结合能最低的3种成分分别与VCAM-1（PDB ID：1VCA）和ICAM-1（PDB ID：5MZA）进行分子对接，结果见表2和图6。基异黄酮（7-Methoxy-2-methyl isoflavone，甘草）、刺芒柄花素（formononetin，甘草）、槲皮素 （quercetin，甘草）、β-谷甾醇（β-sitosterol，生姜）等35种化学成分能作用于20个以上的 PH靶点基因，可认为是茯苓甘草汤作用于PH的主要活性成分。由图一可直观体现化合物与靶点的相互作用关系，为茯苓甘草汤对PH的多靶点治疗机制提供了参考，对中医药理论的整体观念有着较好的体现。经靶点映射，共获得茯苓甘草汤治疗PH的潜在靶点基因91个，且各个靶点、通路相互协同发挥作用，提示这可能是茯苓甘草汤治肺动脉高压的关键。其中槲皮素可作用于66种靶点，其在抗炎、降血脂、抗血小板聚集、抗氧化、抗肿瘤等多方面都有较好的成效[13-14]。有研究表明槲皮素具有抑制肺动脉血管收缩和降低血压的功效，并且在野百合碱诱导的PH大鼠模型中，槲皮素可显著逆转PH的形成[15-16]。

表2 核心化合物与VCAM-1及ICAM-1结合亲和力

图6 VCAM-1、ICAM-1与核心化合物的分子对接模式

本研究 PPI 网络分析结果显示EGFR、CTNNB1、UBC、YWHAZ、PRS27A、HSP90AB1等 靶 蛋 白 与细胞的转化生长以及细胞间的黏附有密切关系，与炎症、肿瘤、癌症等疾病的发生与转移密切相关，如HSP90AB1在肺癌组织中的表达水平显著高于在正常肺组织中的表达[17-18]。在GO分析中在生物过程中主要富集的条目为类固醇激素反应（response to steroid hormone），酮反应（response to ketone）、对外来生物刺激的反应（response to xenobiotic stimulus）在细胞分化/发育、增殖和代谢中发挥不可或缺作用。在靶点-信号通路网络图中，得到自由度较高的靶点有 RAF1、CCND1、MAPK10。RAF1与CCND1与癌症的出现与发展关系密切，主要影响细胞增殖，细胞周期等，其中CCND1还与炎症、能量代谢以及肿瘤干细胞等关系密切[19-20]。MAKP10（丝裂原活化蛋白激酶10）与细胞分化、生长、增殖、免疫调控等多种细胞活动关系密切[21]。KEGG富集分析显示现流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路是细胞内外信号转导一个重要纽带，在细胞抗凋亡、增殖、分化以及对环境的应激适应、炎症反应等多种重要的细胞生理/病理过程中起到至关重要作用。

VCAM-1、ICAM-1是流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路上的重要蛋白，在正常生理情况下VCAM-1和ICAM-1呈低表达水平状态，在缺氧、病原微生物等各种刺激因素影响后表达出现异常上调，易引起促炎因子表达升高以及单核细胞和内皮细胞发生粘连，持续地异常表达可导致心肺等组织器官结构和功能的损伤，广泛参与支气管哮喘、动脉粥样硬化等病理过程[22-23]。有研究表明，肺组织VCAM-1和ICAM-1表达的提高与PH的形成有关，并通过抑制其在肺组织中的表达来进行治疗[24]。通过网络药理学分析，该方中评分最高的15个化合物中与VCAM-1和ICAM-1进行分子对接的对比研究结果说明shinpterocarpin、7-Methoxy-2-methyl isoflavone、Licoagrocarpin等可能是茯苓甘草汤治疗肺动脉高压的关键成分。

综上所述，茯苓甘草汤作用于PH是多成分、多靶点、多途径的复杂机制过程，网络药理学初步预测、探索了其治疗PH的药效物质基础和分子生物学机制，也为中药复方治疗PH 提供了机制研究方面的思路借鉴。