川芎红花药对“异病同治”缺血性脑卒中和失眠中的 机制分析

刘梦，张文静，吕穆杰，郭闫葵

1 山东中医药大学第一临床医学院 山东济南 250355 2 山东省济南市中医医院 山东济南 250000

缺血性脑卒中是因脑血管阻塞或血液供应障碍，导致脑组织缺血缺氧性病变坏死，进而产生临床上对应的神经功能缺失表现，约占卒中患者总数的 75%～85%[1]。失眠是指由于人体睡眠-觉醒系统紊乱，导致睡眠不足或睡眠不连贯，并伴有心烦、多梦等症状，对失眠有忧虑或恐惧心理可形成恶性循环， 从而使症状持续存在[2]。失眠是脑卒中后常见的并发症，脑卒中后失眠发病率75%～95%，缺血性脑卒中患者发病率更高[3]。同时，失眠也会增加缺血性脑卒中的发病风险，失眠会导致交感神经兴奋性增高、下丘脑-垂体-肾上腺轴的激活，使再梗死的危险系数加大[4]。因此，发挥中医中药治疗毒副作用小、无药物依赖等的特点和优势，寻求新的治疗方法改善患者的症状，对疾病的预后和减少复发意义重大。

川芎辛温香燥，《神农本草经》将其列为上品， 称其“主中风入脑头痛，寒痹……”。红花性味辛温，为治瘀血阻滞之要药，常与川芎相须为用。临床上，川芎红花常用于治疗中风病，用以活血化瘀，化痰通络。周建伟等以活血化瘀为主的基本方 （芍药、川芎、红花、当归、生地、丹参）治疗老年失眠22例， 有效率优于对照组[5]。说明川芎红花在治疗缺血性脑卒中与失眠均有一定疗效。药理研究显示，红花中富含多种黄酮类、生物碱类物质，可通过上调一氧化氮合成酶活性、清除脑自由基，从而起到神经保护作用[6]。川芎可通过抑制NF-κB 信号通路减少脑缺血后梗死面积，降低OGD胶质细胞凋亡率，发挥神经保护作用[7]。但川芎红花治疗缺血性脑卒中与失眠合病的内在分子作用机制未见报道，应进入深入研究。

近年来，基于网络药理学理论探讨中药异病同治的研究也逐渐出现，从整体系统的角度阐释了药物异病同治的分子机制。因川芎红花药对对干预两种疾病“异病同治”的内在分子作用机制尚不清楚。因此，本研究基于网络药理学，通过“异病同治”角度来阐述川芎红花治疗缺血性脑卒中以及失眠的分子作用机制，为后续临床以及实验研究提供理论基础。

资料与方法

1 川芎-红花有效成分的筛选及靶点预测

在TCMSP 数据库（中药系统药理学分析平台 https://tcmsp-e.com/）中检索川芎、红花，设定筛选条件为生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18，血脑屏障穿透性BBB≥-0.3得到有效化学成分及对应靶点；查找有效成分sdf结构式导入swisstargetprediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）得到对应靶点。将两种方法得到的有效成分靶点信息整合，通过Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）对筛选的靶点进行名称标准化处理。

2 疾病的相关靶点预测

通 过DrugBank（https://www.drugbank.ca/）、DisGeneT（http://www.disgenet.org/web/DisGeneT/menu/ho）、OMIM（https://omim.org/）、Genecards（https://www.genecards.org/）数据库，分别以关键词“Cerebral ischemic stoke”、“insomnia”检索缺血性脑卒中以及失眠的相关基因，并将得到的基因整合去重得到疾病靶点。

3 成分-靶点-疾病网络构建

通过Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），将药物预测的靶点与两种疾病预测的靶点取交集，获得川芎-红花异病同治缺血性脑卒中和失眠的共同作用靶点。把药物的有效成分与共同作用靶点导入Cytoscape3.8.2构建成分-靶点-疾病网络。

4 共同靶点相互作用网络

将筛选得到的共同靶点上传到 String在线基因数据库（https://string-db.org/），物种选择为人类，保存结果中的tsv文件。将文件导入Cytoscape3.8.2构建可视化网络，并利用MCODE插件对该网络进行聚类分析，筛选出关键靶点。

5 GO功能及KEGG生物通路富集分析

将潜在靶点输入Metascape数据库（（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1），限定物种为人，筛选P＜0.01，分别进行GO功能及KEGG生物通路分析，将得到的结果通过微生信在线数据分析平台（http://www.bioinformatics.com.cn/?p=5）进行可视化。

6 分子对接

iGEMDOCK 是一个集成环境，它集成了大量修改和增强的内部工具蛋白质配体图谱、药理相互作用和化合物簇。药理相互作用对于活性化合物的结合往往是必不可少的，并涉及生物机制。药理相互作用可以减少基于能量的评分函数的不良影响，以提高 VS 的命中率[8]。其能量打分函数通过蛋白质-化合物相互作用的静电、氢键和范德华力打分，化合物分子与受体结合的构象稳定时能量越低，结合性越高[9]。首先导入从PDB数据库（https: //www.rcsb.org/）中搜索的蛋白结构，其次下载核心成分的mol格式文件，选择标准对接模式进行对接。

结 果

1 川芎-红花有效成分筛选及靶点预测

在TCMSP数据库中检索川芎共有189种化学成分，红花共189种化学成分，经筛选OB≥30%， DL≥0.18，BBB≥-0.3后得到川芎6种主要成分，红花12种主要成分，见表1。通过swisstargetprediction数据库及TCMSP数据库预测靶点，经由Uniprot数据库校对后，获得红花靶点388个，川芎靶点359个，合并后共有靶点537个。其中八氢番茄红素、六氢番茄红素无相关靶点。

表1 川芎-红花主要活性成分

2 疾病的相关靶点预测

检索到缺血性脑卒中靶点共982个，失眠靶点共1169个。

3 共同靶点靶点预测

将川芎-红花预测得到的537个靶点与疾病预测的靶点导入venny2.1.0得到共同靶点72个，见图1。这些靶点为川芎-红花异病同治缺血性脑卒中及失眠的潜在作用靶点。

图1 川芎-红花治疗缺血性脑卒中及失眠的潜在靶点韦恩图

4 成分-靶点-疾病网络构建

把有效成分与潜在靶点导入Cytoscape3.8.2构建成分-靶点-疾病网络，见图2。网络共有92个节点，382条边，经拓扑分析后得出成分的最大度值为28，度值＞15的成分有黄芩素（baicalein）、β-谷甾 醇（beta-sitosterol）、豆 甾 醇（Stigmasterol）、木 脂素（Lignan）、红花素（Carthamidin）、川芎萘呋内酯（Wallichilide），推测这些成分可能是药物治疗疾病的核心成分。

图2 成分-靶点-疾病网络

5 靶点相互作用网络构建

将从string下载好的文件导入Cytoscape3.8.2得到共同靶点相互作用的网络，见图3。网络有72个节点，586条边，聚类分析后共得到5个子网络。根据得分最高创建潜在靶点网络图，共得到21个核心靶点，见图4，再根据接近中心性（ClosenessCentrality）和度值（Degree）排序，排名较前的蛋白有AKT1、FOS、CASP3、APP，推测这些蛋白是川芎红花干预卒中及失眠的关键靶点。

图3 共同靶点PPI作用网络

图4 潜在靶点PPI作用网络

6 KEGG分析

潜在靶点共涉及199条通路，根据p值由小到大进行排序选取与人类相关的前20条通路并进行可视化，具体信息见表2、图5。与疾病相关的主要通路有神经活性配体-受体相互作用、环腺苷酸信号通路、钙信号通路、胆碱能突触等信号通路，并将主要信号通路可视化，见图6-图9。

图5 潜在作用靶点的KEGG通路

图6 神经活性配体-受体相互作用

图9 胆碱能突触

表2 川芎-红花治疗缺血性脑卒中及失眠潜在作用靶点的KEGG通路

7 GO 分析

潜在靶点涉及的生物过程（BP）1314条，分子功能（MF）115条，细胞组分（CC）99条，根据富集值排序，选取前10个条目，其主要参与的生物过程有肾上腺素-去甲肾上腺素对心率的正调节作用、腺苷酸环化酶抑制G蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路、神经元-胶质细胞信号、肾上腺素-去甲肾上腺素对血压的正向调节作用等，主要分子功能有α1 -肾上腺素受体活性、G蛋白偶联乙酰胆碱受体活性、肾上腺素受体活性、G蛋白偶联的神经递质受体活性等，主要细胞组分有多巴胺能突触、轴膜、突触前膜的整体成分、树突骨架等。具体见图10。

图10 川芎红花干预缺血性脑卒中及失眠的潜在靶点GO分析

8 分子对接

采用iGEMDOCK V2.1软件将川芎红花的核心成分黄芩素、β-谷甾醇、豆甾醇、木脂素、红花素、川芎萘呋内酯，与筛选的关键靶点AKT1、FOS、CASP3、APP进行分子对接，对接结果见表3，其中结合性最强的是APP与lignan，见图11。

表3 成分与靶点对接结果

图11 APP与lignan分子对接图

讨 论

图7 环腺苷酸信号通路

图8 钙信号通路

缺血性脑卒中和失眠是两种常见的神经系统疾病。现代研究表明，脑缺血后会引起Ca2+内流、神经炎性反应、细胞凋亡、氧化应激反应，并激活TLR4/NF-κB信号通路、MAPK信号通路等，进一步促进炎症细胞因子的产生与神经细胞凋亡，破坏血脑屏障，加重缺血性损伤[10-11]。失眠的病理机制较为复杂，当机体处于应激状态时，会调节下丘脑生物钟节律、神经递质、褪黑素以及细胞炎症因子的生成，有多种因素共同参与，任何环节的异常均会引起失眠的发生[12]。根据两种疾病的潜在机制联系，为两种疾病的交叉治疗提供新方法，有助于深入理解神经系统疾病及寻找更有效的治疗。

通过查阅相关文献发现川芎红花的主要作用成分大部分在本次研究中有所体现，但羟基红花黄色素A、川芎嗪、6-羟基山奈酚因不符合筛选条件而未纳入研究，说明此法仍有不充足和完善的地方，需要根据实验验证以及文献整理加以补充。在筛选得到的主要成分中，黄芩素可显著抑制NF-κB、i NOS、COX-2的表达及磷酸化，减少神经炎性因子的释放，改善氧化应激，发挥神经保护作用[13]。β-谷甾醇可通过血脑屏障，影响GABA神经突触通路，调节神经营养因子，并进入线粒体，提高线粒体跨膜电位和ATP量，从而减少神经元的凋亡[14]。除此之外，β-谷甾醇可抑制NF- κ B p65、p38 和 ERK的磷酸化，减少小胶质细胞中促炎介质的产生，保护神经元[15]。]木脂素可调节肠道微生物菌群分泌神经递质和神经肽，通过肠脑轴增加脑循环中一氧化氮的水平，调节血管张力、血管舒张和血流[16]。豆甾醇能减少自由基的产生和脂质过氧化，从而表现出良好的抗氧化损伤作用。还可抑制 NF-κB通路，降低 NO 水平和 COX-2 表达并减少其介导的神经损伤，减少促凋亡基因、caspase-3 和增加抗凋亡基因来保护神经细胞[17]。通过对主要化学成分的分析可发现成分可通过抑制神经细胞凋亡、减少神经炎性反应、抗氧化应激达到干预疾病的目的。

本研究通过靶点蛋白相互作用网络提取AKT1、FOS、CASP3、APP共4个关键靶点。AKT1能够活化NF-κB炎症信号通路，激活NF-κB二聚体并转移到细胞核内促进炎症因子转录，导致失眠的发生[18]。生物钟基因可激活AKT信号通路调节受损的神经细胞，同时AKT信号通路可磷酸化Clock基因，改变和Bmal1的结合，调节昼夜节律[19]。C-FOS可调控氧化应激和线粒体功能、抑制神经细胞凋亡来调节缺血性卒中过程，并推测C-FOS可调控失眠大鼠神经细胞凋亡过程来调节快速动眼睡眠[20-21]。Casp-3 是内源性和外源性凋亡途径的汇合点，是凋亡的主要执行者，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经途径，降低脑组织中Casp-3的表达可减少缺血后脑组织中神经细胞的凋亡[22]。此外，在大鼠睡眠剥夺后，会激活Casp-3，诱导神经细胞凋亡，加重脑损伤和神经功能障碍[23]。APP可控制GABA能突触传递，对神经元、轴突形成、树突分支和树突棘起营养作用。还可通过调节L型钙通道调节细胞内钙稳态，抑制钙振荡，在控制神经元兴奋性中起关键作用[24]。本研究表明，川芎红花药对主要通过调节炎症因子、影响昼夜节律、减少神经细胞凋亡、促进神经营养因子的表达来发挥治疗缺血性脑卒中以及失眠的作用。

通过KEGG分析，神经活性配体-受体相互作用通路在生理学上与神经功能的关系最为密切。cAMP通路可由5-HT1AR介导，调控PKA基因参与睡眠和昼夜节律调控，延长慢波睡眠和总睡眠时间，缩短入睡潜伏期，有明显的促睡眠效应[25]。脑缺血后会激活处于神经元突触位置的γ-氨基丁酸B受体（GABAB），降低细胞内的cAMP浓度，妨碍神经元突触部位的囊泡聚集，对神经元的内生长状态产生不利影响[26]。脑缺血时，氧化应激损伤等原因可以增加Ca2+内流，引起细胞内Ca2+超载，导致Ca2+级联反应， 加重缺血脑组织区细胞线粒体膜损伤，引发脑神经元的细胞凋亡。此外，胞内Ca2+可以与Ca M结合形成复合物，促进神经递质5-羟色胺和去甲肾上腺素的释放来引起缺血脑组织的血管发生强烈收缩，从而加重脑缺血、缺氧的程度，造成恶性循环[27]。且研究发现，L-型钙通道阻断剂可通过影响Ca2+信号通路中的下游分子蛋白激酶C和钙调蛋白II来促进戊巴比妥钠诱导的催眠[28]。 基于胆碱能神经调节和抑制全身炎症反应的功能提出胆碱能抗炎通路，由迷走神经，乙酰胆碱和乙酰胆碱受体组成，可通过转导NF- κ B 信号通路、JAK/STAT信号通路、AMPK信号通路以及PI3K/AKT信号通路调控炎症因子释放，发挥抗炎作用，减轻脑缺血后神经细胞的炎症损伤[29]。这些结果可能会为增强缺血性脑卒中以及失眠的大脑修复提供新的治疗策略。同时，GO分析的结果也提示这些信号通路或途径是川芎红花“异病同治”潜在作用机制。综上所述，川芎红花主要通过神经活性配体-受体相互作用、环腺苷酸信号通路、钙信号通路、胆碱能突触等信号通路来减少神经细胞凋亡，参与昼夜节律调控、调控炎症因子释放，发挥异病同治缺血性脑卒中、失眠的作用。

综上，川芎、红花可能通过多成分，多靶点，多通路改善缺血性脑卒中以及失眠。基于网络药理学与分子对接相结合的技术手段探讨其改善缺血性脑卒中以及失眠的作用机制为后续深入验证川芎、红花改善缺血性脑卒中以及失眠的作用机制奠定基础。但由于中药成分复杂，数据库中仅纳入已知的成分研究，新的化学成分及分子机制未完全纳入，存在一定局限性。网络药理学是一种基于分子网络数据及计算机模拟分析的研究技术，因此对于川芎-红花药对的剂量、给药时间等因素对药效的影响，以及各项数据库的纳入范围、计算方法等对于数据预测的影响，后续工作将结合体内外实验进一步加以证实。