四妙四逆散治疗慢性宫颈炎作用机制探讨*

佘序华，冯丽平，黄玉梅，秦继胜

广西桂林市中西医结合医院 广西桂林 541004

慢性宫颈炎（chronic cervicitis，CC）是临床常见的女性生殖道炎症性疾病，其病理表现是宫颈间质中大量炎症细胞的浸润，最常见的局部病理特征是宫颈糜烂，以阴道分泌物增多、接触性出血、腰骶部疼痛等为主要症状表现[1-3]。慢性宫颈炎属于中医学带下病范畴，本文所研究的四妙四逆散是根据其湿热下注的基本病机所创制的临床有效经验方[4-5]，由柴胡、黄柏、白芍、苍术、枳实、薏苡仁、牛膝、甘草八味中药组成，具有清热利湿止带，疏肝解郁理气功效，广泛运用于慢性宫颈炎的临床治疗，具有抑制病原体感染，促进炎症因子的吸收，改善微循环，增强自身免疫调节等作用。本研究为进一步探究四妙四逆散治疗慢性宫颈炎的潜在机制，采用网络药理学方法及分子对接技术探讨其核心化合物及核心靶点的相互作用，为四妙四逆散的临床应用提供依据。

材料与方法

1 筛选四妙四逆散的有效化合物及靶点

运用中药系统药理学数据库和分析平台（http://tcmspw.com/tcmsp.php）筛选四妙四逆散中符合口服生物利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18的有效化合物，并通过进行靶点注释。

2 筛选四妙四逆散治疗慢性宫颈炎的作用靶点及化合物

通 过GeneCards数 据 库（https：//www.genecards. org）检索“chronic cervicitis”相关的疾病靶点，在Venny软件中导入四妙四逆散的有效靶点及慢性宫颈炎的疾病靶点并筛选交集基因，获得作用靶点。

3 构建四妙四逆散治疗慢性宫颈炎的中药-化合物-靶点网络

在Cytoscape 3.8.2软件导入作用靶点和化合物，构建四妙四逆散治疗慢性宫颈炎的“中药-化合物-靶点”网络并对该网络进行核心成分分析。选择高连接度的化合物作为核心成分。

4 构建蛋白质相互作用网络及拓扑网络

在Cytoscape 3.8.2软件导入作用靶点，选择Between Centrality、Closeness Centrality、Degree Centrality进行分析，构建拓扑网络并筛选枢纽靶点。在String数据库（http://string-db.org）导入作用靶点，构建蛋白质互作网络，筛选核心靶点。

5 四妙四逆散治疗慢性宫颈炎的GO和KEGG富集分析

使用DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）和KEGG（https://www.kegg.jp/）对四妙四逆散治疗慢性宫颈炎的靶点进行基因本体论和KEGG富集分析和可视化。

6 四妙四逆散治疗慢性宫颈炎的核心靶点与成分的分子对接

在PDB数据库（http://www.rcsb.org/）及pubchem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载核心靶点及成分结构，运用AutoDock软件进行去水、加氢及计算电荷处理后以蛋白自带配体为中心构建对接口袋，并进行分子对接计算结合能分值。最后选择对接分值最佳的受体-配体结构进行绘图。

结 果

1 四妙四逆散的有效化合物及靶点

通过TCMSP数据库共筛选得到155个有效化合物，其中柴胡12、黄柏25、白芍8个、苍术4、枳实18、薏苡仁6、牛膝15、甘草88。对所得化合物进行基因注释，共得到259种有效靶点。

2 四妙四逆散治疗慢性宫颈炎的作用靶点

检索GeneCards数据库得到与慢性宫颈炎相关的疾病靶点共5526个，运用Venny软件与四妙四逆散的259个有效靶点进行取交集后，最终获得四妙四逆散治疗慢性宫颈炎的作用靶点共215个。

3 四妙四逆散治疗慢性宫颈炎的中药-化合物-靶点网络

在Cytoscape3.8.2软件中构建四妙四逆散治疗慢性宫颈炎的“中药-化合物-靶点”网络（图1），连接度排名在前4位的化合物依次为Quercetin（槲皮素）、luteolin（木犀草素）、kaempferol（山奈酚）、wogonin（黄芩素），即是四妙四逆散治疗慢性宫颈炎的核心化合物。

图1 中药-活性成分-靶点网络

4 蛋白质相互作用网络

在cytoscape3.8.2中导入215个作用靶点，构建拓扑网络（图2），得到四妙四逆散治疗慢性宫颈炎作用靶点中的枢纽靶点。同时导入String数据库，构建靶点所编码的蛋白质之间相互作用的网络图（图3），根据连接度排名将蛋白进行条形排列（图4），连接度排名在前4位的作用靶点依次为AKT1（丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）、IL6（白细胞介素-6）、MAPK3（丝裂原活化蛋白激酶3）、VEGFA（血管内皮生长因子A），这与拓扑网络得到的枢纽靶点结果一致，因此认为AKT1、IL6、MAPK3及VEGFA即为四妙四逆散治疗慢性宫颈炎的核心靶点。

图2 四妙四逆散治疗慢性宫颈炎的拓扑网络

图3 作用靶点的蛋白互作网络图

图4 作用靶点的节点数量条形图

5 四妙四逆散治疗慢性宫颈炎的GO及KEGG富集结果

四妙四逆散治疗慢性宫颈炎的GO 富集结果共包含2492生物过程（biological process）、135个细胞成分（cellular component）及212个分子功能（Molecular Function）。结果显示四妙四逆散治疗慢性宫颈炎中所调节的生物过程和分子功能主要涉及细胞信号转导和转录、蛋白结合、抗炎、抗氧化、促进免疫应答等方面。KEGG富集共获得173 条通路，其中得到四妙四逆散与慢性宫颈炎的相关的通路有PI3K-Akt信号通路、IL-17 信号通路、TNF信号通路、Th17细胞分化信号通路、HIF-1信号通路、p53信号通路等。

6 分子对接

分子对接结果显示槲皮素、木犀草素、山奈酚、黄芩素等核心化合物与 AKT1、IL-6、MAPK3及VEGFA 等核心靶点具有较好的对接，其中有4对接结果的结合能＜-9.0（图5），且均来自AKT1与四个核心化合物的对接，因此推测AKT1可能是四妙四逆散治疗慢性宫颈炎的重要靶点。

图5 分子对接结合能结果

讨 论

本研究运用网络药理学方法和分子对接技术探讨四妙四逆散治疗慢性宫颈炎的作用机制，结果显示四妙四逆散治疗慢性宫颈炎具有多成分、多靶点的作用特点。其作用核心化合物槲皮素、木犀草素、山奈酚、汉黄芩素均属于黄酮类化合物，大量实验证实黄酮类化合物具有调控细胞周期、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤生长、提高抗氧化、清除自由基、抗炎抑菌、抑制血管生成、提高机体免疫应答等作用。朱慧敏[6]发现槲皮素能抑制宫颈炎大鼠宫颈组织中炎性因子的表达，减轻炎症反应。冯艳红等[7]研究显示槲皮素能抑制宫颈鳞状细胞癌细胞增殖，且与槲皮素浓度及作用时间呈正相关。潘磊等[8]发现木犀草素能通过抑制Ras-MAPK信号通路及其下游MMP9、Cyc D1、VEGF等蛋白表达，发挥促进宫颈癌细胞凋亡、抑制细胞增殖迁移的作用。王颖等[9]研究显示木犀草素能抑制宫颈癌细胞增殖迁移，推测其机制可能与抑制PI3KAKT信号通路活化，抑制其增殖、迁移的相关蛋白表达相关。蔡云朗等[10]发现山奈酚能抑制子宫肌瘤细胞增殖，下调ER、IGF1和VEGF等蛋白及基因表达。汉黄芩素还具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、调节肿瘤细胞侵袭及血管生成等多方面活性作用[11]。

四妙四逆散治疗慢性宫颈炎的蛋白拓扑分析及蛋白互作网络显示其核心靶点为AKT1、IL6、MAPK3及VEGFA。AKT1是PI3K/AKT通路的中枢靶点，活化的AKT1可调节其多个下游靶标发挥调控细胞的增殖和凋亡、细胞侵袭和转移、DNA修复、细胞周期及血管生成等作用[12-14]。杜趁香等[15]发现AKT1在慢性宫颈炎及宫颈癌病变组织中呈高表达，刘小叶[16]发现通过下调AKT1蛋白的表达可达到抑制宫颈癌细胞增殖的作用。IL6作为一种细胞因子级联反应中的核心介质，参与调节机体免疫应答、炎症反应及肿瘤细胞增殖。邵丹等[17]研究发现宫颈癌患者血清中IL-6水平明显升高，且与病情进展程度呈正相关。磷酸化激活后的MAPK3参与从细胞骨架变化到基因转录的各种细胞反应，具有调控细胞周期和信号转导、抑制细胞增殖分化、诱导免疫应答及维持细胞稳态等作用[18-19]。曹学全等[20]研究发现在慢性宫颈炎、宫颈炎组织中MAPK3蛋白呈高表达，且其升高水平与疾病进展相关。蒋丹[21]发现MAPK3在宫颈癌组织中呈高表达水平，且与凋亡抑制基因bcl-2在宫颈癌的发生发展中存在协同作用。VEGFA是一种血管内皮生长因子，参与调控血管形态和功能，可诱导肿瘤血管生成，对肿瘤的发生发展起重要作用。朱迎萍等[22]运用自拟宫颈方治疗宫颈炎模型大鼠，发现大鼠宫颈组织的炎症程度与VEGFA、NF-KB等蛋白的表达水平有关。徐美容等[23]研究发现VEGFA在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变及宫颈癌组织中的表达呈逐渐上升趋势，且其表达水平还与宫颈间质浸润深度、肿瘤直径等相关，可作为宫颈癌组织中的生物标志物。

分子对接结果显示四妙四逆散的核心化合物与其核心靶点有较好的结合作用，其中 AK1与槲皮素、木犀草素、山奈酚、黄芩素的相互作用更佳，推测AK1可能是四妙四逆散核心化合物干预的主要靶点。其作用靶点富集的GO功能涉及细胞信号转导和转录、蛋白结合、抗炎、抗氧化、促进免疫应答等多个方面。通路富集结果显示四妙四逆散治疗慢性宫颈炎治疗可能通过调控PI3K-Akt、p53、TNF、HIF-1、IL-17、Th17 细胞分化等信号通路达到抑制细胞增殖、抑制肿瘤血管生成、提高肿瘤免疫应答等作用。

本研究运用网络药理学及分子对接方法发现四妙四逆散治疗慢性宫颈炎具有多成分、多靶点、多通路的作用特点，结合核心靶点富集的GO与通路结果，推测四妙四逆散治疗慢性宫颈炎可能通过槲皮素、木犀草素、山奈酚、汉黄芩素等化合物调节AKT1、IL6、MAPK3及VEGFA等蛋白水平，发挥调控细胞信号周期、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、抗炎、抗氧化、促进免疫应答等作用。