旴江医家龚廷贤治疗中风的用药规律及作用机制探究

徐小港，徐义峰，王钰，董辛，章德林，郑琴，3

1 江西中医药大学 江西南昌 330004 2 江西中医药大学科技学院 江西南昌 330004 3 现代中药制剂教育部重点实验室 江西南昌 330004

龚廷贤，明代御医，江西金溪人，被誉为“医林状元”。龚氏不仅秉承家学，且博综诸家，以制方萃味，用药精简著称，广泛涉猎临床各科，可谓地方医学流派的一代大家。他一生精究医源，勤于笔耕，所撰著作达二十余种。龚氏对于中风的病证之源、方药之制详审缜密，考古证今，对现代临床相关疾病诊疗具有一定的借鉴意义。

中风原指感受风邪所引起的疾病，在《医学三字经》中有“人百病，首中风”之称。古代医家对本病的理解与诠释不尽相同，其内涵与范畴也较为广泛，主要以口舌歪斜、半身不遂等突发性症状为共同特征。随着中医行业规范与标准的建立，中风的概念渐趋明确，现指代缺血性脑卒中及脑梗塞等疾病，属于中医内科重大病证之一。本病是全球第二大死亡原因，且已成为中国成年人首要致死及致残疾病[1]， 其中40岁以上成年人中风患病率为2.06%[2]，造成了严重的社会负担[3-4]。

从中风的病因病机而论，龚廷贤在《万病回春》中指出：“真中风者，中时卒倒，皆因体气虚弱，荣卫失调，或喜怒忧思悲恐惊，或酒色劳力所伤，以致真气耗散，腠理不密，风邪乘虚而入，乃其中也”。对于本病的辨证，龚氏善于通过患者脉象细审明析及判断预后，《寿世保元》有载：“夹寒则脉带浮迟，夹暑则脉虚，夹湿则脉涩。大法浮迟者吉，急疾大数者凶”。在中风的治疗上，他强调应精准辨明病因，理清中腑、中脏、中经络及兼夹证候，变通而治之。如对于中风有昏冒现象者，《鲁府禁方》主张宜用通关之药，即“先用皂角、细辛等分为末，每用少许吹入鼻中，有嚏可治，随用吐法”。鉴于龚廷贤在中风诊治方面的良好疗效与鲜明特色，本研究采用现代信息技术，通过数据挖掘阐明其治疗中风的用药规律与学术思想，并提取核心药物组合。采用网络药理学方法分析其生物学作用机制，以期为中风的临床用药及相关实验提供理论参考，具体研究流程图如下。

材料与方法

1 处方来源与处理

处方均来源于《龚延贤医学全书》[5]中所包含的《鲁府禁方》、《万病回春》、《寿世保元》、《济世全书》四书中治疗中风的方剂。

1.1 筛选标准 ①纳入所载处方有明确的药物组成、服用方式为内服；②排除处方为单味药物、用药方式为外用、《中药学》[6]、2020版《中国药典》[7]及《中药大辞典》[8]均不收录的药物；③组成重复的处方仅记录一次。

1.2 数据的规范与数据库的建立 根据筛选标准，确定纳入处方，依照《中药学》及2020版《中国药典》，对中药药名进行规范，并且作为性味、归经统计参照，《中药大辞典》作为补充。如仙灵脾规范为淫羊藿，淮安陈曲规范为陈皮、神曲，当归尾规范为当归，辽五味子规范为五味子，将1.1.1提及的未收录药物，予以剔除，如脑末、洛阳花等，按《中药学》对中药功效进行归类，最后通过Ms Excel 2016建立龚延贤治疗中风方药数据库。

1.3 数据分析 对数据库中单味药、性味、归经，功效分类进行频数、频率分析，采用IBM SPSS Modeler 18.0[9-11]软件对药物进行关联规则分析并提取核心药物组合（支持度最高），运用IBM SPSS Statistics 26.0进行聚类分析[12-13]。

2 核心药物组合网络药理学分析

2.1 药物的成分及靶点收集 在中医分子机理生物学信息分析工具（BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）依次检索麦冬-肉桂的有效成分及靶点，检索条件为Score cutoff≥20、P-value cutoff＜0.05[14]。

2.2 疾病的靶点收集及Venny分析 因缺血性脑卒中占中风发病率的80%以上，具有致死率和致残率高的特点[15]。为更加明确药物的作用机制，故以缺血性脑卒中为主要研究对象，并将缺血性脑卒中（cerebral ischemic stroke）、脑梗死（cerebral infarction）和脑缺血再灌注（cerebral ischemia reperfusion）为关键词，在人类在线孟德尔遗传平台OMIM（https://omim.org/）以及DrugBank（https://www.drugbank.ca）中检索相关基因，并与药对中有效成分靶基因进行映射对比筛选出药对治疗缺血性脑卒中的作用靶点。将药物的靶点与疾病的相关靶点导入hiplot （https://hiplot.com.cn/），得到麦冬-肉桂治疗中风的潜在作用靶点。

2.3 “药对-化合物-基因-疾病”网络构建 结合药物成分及1.2.2所得潜在作用靶点，导入Cytoscape3.7.1软件构建 “药对-化合物-基因-疾病”网络，并运用其中Network Analysis分析有效成分的网络拓扑参数，以确定核心成分。

2.4 作用靶点的PPI网络构建 将作用靶点导入STRING数据库（https://string-db.org/），生物种类设定为“Homo sapiens”，最小互相作用阈值设为“medium confidence”（＞0.4），得到蛋白互作网络图及保存TSV格式的PPI数据，将PPI数据文件导入Cytoscape3.7.1中的Network Analysis分析有效成分的网络拓扑参数。

2.5 富集分析 将作用靶点导入DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/），Select Identifier设 置 为“OFFICIAL GENE SYMBOL”，“Select species”设置为“Homo sapiens”，设定P＜0.05，实现GO功能富集分析和KEGG通路富集分析[16-17]。

结 果

1 数据分析

1.1 高频药物频次、归经统计 共录入94首处方，根据筛选标准，最终纳入63首处方，总计163味药物，进行“频次统计”，药物总频次达1029次，高频药物（频次＞16，下同）共计20味，频次最高的药物为甘草出现35次，其次是茯苓、防风、当归、川芎，高频药物归经以脾、肺、肝为主。见图2。

图2 高频药物频次、归经分布聚类图（频次＞16次）

1.2 药物功效分类统计 将涉及的163味药物功效分类和频次统计分析，共涵盖19种功效分类，主要集中在补虚药（255次，24 .78%），解表药（163次，15.84%）。见图3。

1.3 药物性味统计 将涉及的163味药物进行性味统计分析。同一味药物的多个药性、药味分别统计入内。药性中主要集中在温（552次，33.22%）＞寒（195次，28.10%）＞平（187次，25.34%），药味主要集中在辛（565次，54.33%）＞甘（195次，19.15%）＞苦（187次，18.41%），见图4。

图4 药物性味频次分布图

1.4 药物归经统计 将涉及的163味药物进行归经统计分析。按照频数由高到低的顺序进行排序，归经前3位为脾经、肺经、肝经，累计频次均＞400，其频率依次为18.83%，15.65%，14.13%，其排名与2.1.1中高频药物结果相符，可验证数据的准确性，见图5。

图5 药物归经频次分布图

1.5 关联规则 运用IBM SPSS Modeler 18.0软件进行关联规则分析，并建立“数据源（EXCEL）→类型→网络”数据流，设置支持度为30%，置信度为80%，最大前项数为3，提升度＞1等条件进行关联网络可视化，再使用Apriori 算法建模，挖掘药物之间的配伍规律，得到龚廷贤治疗中风的潜在核心药物组合（麦冬-肉桂），见图6。

图6 药物关联图

1.6 聚类分析 采用SPSS Statistics 26.0中的组间联接，选择皮尔逊相关性，对20味高频药物进行系统聚类分析，生成树状图（图7），和冰柱图（图8）。结合专业知识，分析出5个多味药物聚类组合，类1：陈皮、半夏、甘草、茯苓；类2：白术、黄芩；类3：防风、川芎、当归、白芍；类4：白芷、细辛、天麻；类5：生地黄、熟地黄、羌活，见图7、图8。

图7 高频药物聚类树状图

图8 高频药物聚类冰柱图

2 核心药物组合网络药理学分析

2.1 药物的成分及靶点收集 从BATMAN-TCM数据库中得到麦冬、肉桂有效活性成分共34个，其中麦冬18个，肉桂16 个。同时收集活性成分相关作用靶点，其中麦冬305个，肉桂559个，去除重复靶点后，共得到靶点547个。

2.2 疾病的靶点收集及Venny分析 疾病靶点共收集到200个人，其中DrugBank59个，OMIM141个，去除重复靶点，共得到靶点194个，将麦冬-肉桂作用靶点与疾病相关靶点进行Venny分析，获得麦冬-肉桂活性成分作用靶点映射于疾病的潜在作用靶点27个，见图9。

图9 麦冬-肉桂治疗中风靶点venny图

2.3 “药对-化合物-基因-疾病”网络构建 运用Cytoscape3.7.1软件构建“药物-化合物-基因-疾病”网络图， 可直观地显示药物与基因之间的关系，图形节点（紫色）为活性成分，正方形（蓝色）为药物与疾病，菱形（绿色）为基因，面积越大说明该节点越重要。共包含34个化合物，根据结果显示，豆甾醇（Stigmasterol）、鸟嘌呤核苷（Guanosine hydrate）、茴香烯（Anethole）等34个成分为治疗中风的潜在活性成分，见图10。

图1 研究流程图

图10 “药物-化合物-基因”网络图

2.4 PPI网络构建及分析 用STRING数据库得到27个作用靶点之间的关系，并保存TSV文件，将其导入Cytoscape3.7.1，得到PPI网络图，利用内置Network Analysis分析有效成分的网络拓扑参数，发现TNF、PTGS2、ACE、ADRA1A、PDE4A、PTGS1、PDE5A等节点度值较高，其中TNF和其他基因的相互作用最强，提示其可能参与的药理作用最为明显，见图11。

图11 共同基因蛋白互作网络图

2.5 富集分析 通过DAVID数据库对麦冬-肉桂药对作用靶点进行GO富集分析与KEGG通路富集分析，设置阈值P＜0.05，利用Hiplot对结果进行可视化。GO富集分析得到88个条目，包括生物学过程（BP）50条、细胞组成（CC）17条和分子功能（MF）21条，主要有3'， 5'-cyclic-nucleotide phosphodiesterase activity（3'，5'-环核苷酸磷酸二酯酶活性）、3'， 5'-cyclic-GMP phosphodiesterase activity（3'，5'-环-GMP磷酸二酯酶活性）、alpha1-adrenergic receptor activity （α1-肾上腺素受体活性）等，见图12。KEGG 通路富集分析得到22条通路，主要涉及cGMP-PKG信号通路、Arachidonic acid metabolism（花生四烯酸代谢）等，见图13。

图12 GO功能富集分析

图13 KEGG通路富集分析

讨 论

本文基于数据挖掘和网络药理学方法，对龚廷贤治疗中风的63首处方进行配伍规律研究，并将其核心药对进行网络药理学分析。祖国医学认为，本病由于脑络受损，神机失用导致气血逆乱、脏腑功能失调而发。因此，中风多为本虚标实之证，其病位在脑，与五脏密切相关，在本为肝肾阴虚、气血衰少等，在标为风火相煽、痰湿壅盛、瘀血阻滞及气血逆乱等，治疗则根据中经络、中脏腑和后遗症辨证论治。现代研究表明，中风发病机制复杂，主要与脑组织能量代谢障碍、炎症反应、神经内分泌紊乱等密切相关[18-19]。本文通过采用现代信息技术，以期能为中风的临床用药及相关实验提供依据与思路。

根据统计结果，龚廷贤治疗中风的63首方药，以补虚药为先，正如其在《寿世保元·中风》中强调：“予观古人之方，多用攻击之剂，施于北方风土刚劲之人，间或可也，用于南方风土柔弱之人，恐难当耳”，反映了龚氏善用补虚药治疗中风的学术特点。高频药物共计20味，除甘草外，排名靠前依次为茯苓、防风、当归、川芎等，高频药物多入脾、肺、肝三经，且理气药使用占比较大，体现了龚廷贤治风主张理气的学术思想，如《万病回春·中风》指出：“盖治风先理气，气顺则痰消，徐理其风，庶可收敛”。综合评估11个药对和2个药组，发现“麦冬-肉桂”为高频核心药对，麦冬配伍肉桂可清心养阴，补火助阳，一阴一阳，清补兼施，为《石室秘录》倒阳汤结构。聚类分析共包含5个多味药物聚类组合，其组方规律含有燥湿化痰之二陈汤（类1）、和中活血之白术黄芩汤（类2）、养血活血之四物汤（类3）等结构，以及细辛-白芷、生地黄-熟地黄（类4、类5）之配伍，其整体治法与中风本虚标实病机相符。

网络药理学结果显示，豆甾醇、鸟嘌呤核苷、茴香烯等34个成分为治疗中风的潜在活性成分。实验表明，豆甾醇可以有效改善脑缺血再灌注引起的神经功能损伤，进而减少组织病理学缺损[20]，鸟嘌呤核苷亦被证实在缺血性脑卒中动物模型中具有神经保护作用[21]。根据PPI网络发现TNF、PTGS2、ACE等为关键靶点。研究表明，缺血性脑卒中患者在症状发作后12、24、72小时血液中TNF水平均有所升 高[22-24]，并于发病后1～6天在神经元中表达，且在2～3天达到峰值[25]。PTGS2是维持机体稳态和调节炎症的主要应答基因，与缺血性脑卒中的发病密切相关，实验结果亦证实PTGS2的阳性蛋白在大脑中动脉阻塞（MCAO）小鼠模型中的表达显著增高[26]。ACE基因表达失调起到了推动本病发生发展的作用，其通过影响AngⅡ的水平，导致神经元、神经胶质细胞及血管平滑肌细胞中的下游信号传导异常，引发高血压和炎症，从而提高中风的患病风险[27]。

KEGG 通路富集分析发现麦冬-肉桂治疗缺血性中风主要涉及cGMP-PKG信号通路、NF-κB信号通路及Arachidonic acid metabolism（花生四烯酸代谢）等。多项研究表明，炎症反应与缺血性脑卒中的急慢性阶段密切相关，cGMP可调节细胞生长和炎症等多种细胞生物学过程[28]。此外，Phosphodiesterase-5 Inhibitor（磷酸二酯酶-5抑制剂）可增加脑血流量以促进其功能恢复，往往依赖于NO-cGMP-PKG通 路[29]。NF-κB信号通路亦与炎症反应有关，并通过降低细胞的凋亡率及改善脑细胞的细胞周期而作用于缺血性脑卒中[30]。Rink Cameron[31]等研究发现，花生四烯酸代谢在缺血性脑卒中病理机制中具有重要作用。因在缺血性脑卒中环境下，脑部的血液运行被阻滞，此时缺氧的脑组织开始从膜磷脂双层中迅速裂解花生四烯酸，而花生四烯酸能同时进行非酶依赖性和酶介导的氧化代谢，并形成多种有助于缺血性脑卒中病理改善的生物活性代谢物。

本文采用数据挖掘结合网络药理学研究方法，初步阐述了旴江医家龚廷贤治疗中风的用药规律，得出相关核心药对及新方组合，并进一步分析“麦冬-肉桂”药对治疗中风的潜在靶点、活性成分、生物过程及关键信号通路，发现其主要通过cGMP-PKG信号通路、NF-κB信号通路及花生四烯酸代谢等途径发挥作用。综上，本研究可为传承和弘扬旴江名医治疗中风的临证经验与学术思想，以及新药研发提供参考借鉴。