射干麻黄汤治疗支气管哮喘的作用机制研究

逄雪梦，郑心

1 山东中医药大学 山东济南 250014 2 青岛市中医院 山东青岛 266033

支气管哮喘（bronchial asthma，BA）[1-2]是一种与环境和遗传等因素有关的常见呼吸系统疾病，其发病率在我国高达1%。其是以气道慢性炎症为特征的异质性疾病，与气道高反应性有关。支气管哮喘分为发作期与缓解期，发作时主要以喘息胸闷为主，或伴有咳嗽。西医治疗[3-4]BA，主要以吸入抗炎、支气管扩张剂为主，依赖性较强，不能达到良好的治愈效果。中医药治疗呼吸系统疾病疗效确切，副作用小，早已成为新的治疗BA的支持或替代疗法。

射干麻黄汤出自《金匮要略》，主治[5]寒痰郁肺结喉证。其证见咳嗽、气喘、喉间痰鸣似水鸡声，或胸膈满闷，或吐痰涎。方中用射干9g，麻黄12g，生姜12g，细辛、紫菀、款冬花各9g，五味子12g，大枣7枚，半夏12g，诸药合用，共奏温肺化饮、下气祛痰之功。有临床实验[6-8]表明，射干麻黄汤治疗BA总有效率为91.6%，可改善血清嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（ECP）、脂质过氧化物（LPO）、呼出气一氧化氮（FeNO），明显改善患者第1秒用力呼出量/用力肺活量（FEV1/FVC）且改善中医症候积分，缓解喘息、咳嗽、咳痰、胸闷等症状。现代药理学表明[9]，射干麻黄汤治疗BA可降低痰液黏稠度、促进气道纤毛运动、促进痰液排除等。但由于中药方剂成分复杂、作用靶点众多，射干麻黄汤治疗BA的药效基础和作用机制尚不明确，本研究采用中药网络药理学[10]的研究方法，探究射干麻黄汤治疗BA的药效基础与作用机制，为进一步研究提供新的理论研究资料。

材料与方法

1 射干麻黄汤中入血活性成分筛选与靶点预测

检索中药系统药理学数据和分析平台[11]（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform， TCMSP），分别以方剂中各药物为关键词，搜索其所含的化学成分。根据药物代谢动力学[12-14]（absorption and distribution and metabolism and excretion， ADME），将筛选条件定义为生物口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug-likeness，DL）≥0.18，收集有效入血活性成分；并根据平台的成分靶点数据，收集射干麻黄汤中有效入血成分的作用靶点。

2 射干麻黄“有效成分-靶点”网络构建

将上述收集的有效入血活性成分与其作用靶点输入Cytoscape3.2.1[15]，构建“有效成分-靶点”网络图，对射干麻黄汤中的有效成分与作用靶点进行图像的可视化并对网络进行分析。其中，“节点（node）”表示有效成分与作用靶点，“边（edge）”表示成分与靶点之间的关系。

3 与BA相关的疾病靶点检索

GeneCards[16]是包含有 HUGO、GDB（ Human Genome Organization/Genome Database） 命名委员会认可的人类基因有关数据的 Web 网上智能检索系统，收录上万种基因有关数据。本研究以“bronchial asthma”“BA”为关键词，检索Gene Cards数据库，收集与BA相关的疾病靶点。

4 蛋白质相互作用网络构建与关键靶点筛选

使用Cytoscape中的BisoGenet插件，对射干麻黄汤作用靶点与BA相关靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用网络（protein-protein Interaction，PPI）绘制，并使用Merge功能对两网络合并，取取交集，即为射干麻黄汤治疗BA的PPI调控网络。

使用CytoNCA插件[17]，对此网络进行拓扑属性分析，分析指标包括各节点的度中心性（degree centrality，DC）、介度中介性（betweenness centrality，BC）、紧密度中心性（closeness centrality，CC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）、网络中心性（network centrality，NC）和局部边连通性（loal average connectivity，LAC）。首先将BC大于所有节点中位数 2倍的节点定义为big hubs；然后筛选其他各指标均大于所有节点中位数的节点，即为射干麻黄汤治疗BA的关键靶基因。

5 GO生物学过程分析与KEGG信号通路富集分析

将上述关键基因使用DAVID富集分析功能，进行GO生物学过程分析以及KEGG通路富集分析。使用omicshare（http://omicshare.com/tools/home/task/index.html）将通路分析富集结果进行可视化，以气泡图的形式展示。

结 果

1 入血活性成分筛选与靶点预测

在TCMSP数据库中，共检索射干麻黄汤中的成分1494个，其中射干56个，麻黄363个，生姜265个，细辛192个、紫菀91个、款冬花148个，五味子130个，大枣133个，半夏116个。根据ADME筛选原则，共纳入方剂的有效入血活性成分144个，各药物中的有效入血成分数目分布如图1所示。有效成分作用靶点1658个。

图1 根据ADME筛选出的射干麻黄入血活性成分数量

2 射干麻黄汤“有效成分-靶点”网络构建与分析

使用Cytoscpe构建上述活性成分与作用靶点的网络关系图，如图2所示。分析“有效成分-靶点”网络，可知在网络中共包含节点33个，边1802条。其中，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、木犀草素、豆甾醇是位于网络较核心位置的活性成分，其度（Degree）值分别为544、204、156、150、130；较为重要的作用靶点为PTGS2、NCOA2、PTGS1、SCN5A、PPARG。由此可以证实射干麻黄汤各成分在治疗BA上相互协同，通过多靶点、多通路发挥其治疗作用。

图2 射干麻黄汤的“有效成分-靶点”网络

3 与BA相关的疾病靶点的检索

通过检索GeneCards数据库，共收集与BA相关的疾病靶点1832个，将上述靶点输入Cytoscpe构建疾病靶点PPI网络。

4 射干麻黄汤治疗BA的PPI网络构建与关键靶点筛选

分别构建射干麻黄汤的PPI网络与作用靶点的PPI网络。其中，射干麻黄汤PPI网络包含节点2489个，边14650条；BA靶点PPI网络包含节点5907个，边29173条。提取其交集网络，获得射干麻黄汤治疗PPI网络，节点2363个，边14395个。根据筛选原则，筛选出射干麻黄汤治疗BA的关键靶点115个，筛选策略图如图3所示。

图3 射干麻黄汤关键靶点筛选策略

5 GO生物学过程分析与KEGG通路富集分析

使用DAVID对上述关键靶点进行GO生物学过程分析，其共涉及576种生物学过程，其中涉及转录调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、病毒过程、肽基酪氨酸自磷酸化、fcε受体信号通路、信号转导、肽基酪氨酸磷酸化、蛋白质磷酸化、刺激性C型凝集素受体信号通路等生物学过程。对关键靶点进行KEGG通路富集分析，结果显示其共涉及111条信号通路，包括癌症相关信号通路、PI3K/AKT信号通路、神经营养素信号通路、FoxO信号通路、Erbb信号通路、趋化因子信号通路、焦点粘附、TNF信号通路等。富集结果气泡图如图4所示，其中面积表示富集基因数，颜色表示P值。

图4 射干麻黄汤治疗BA信号通路富集分析结果气泡

讨 论

随着全球环境污染的加剧和生化压力的增加等因素，BA成为最常见的慢性病之一，环境大气中的化学触发物（颗粒物质和气体成分，如二氧化氮和臭氧）和生物触发物（空气过敏原），空气过敏原会刺激过敏个体气道过敏 从而诱发支气管哮喘的症状，其发病率及死亡率持续上升，目前全球大约有3亿人患有BA，我国患病人数达3000多万。目前BA的发病机制尚未完全清楚，或与气道的免疫-炎症机制、神经调节机制以及遗传、环境共同作用有关，有学者认为IgE介导的过敏是最重要的诱发因素和致病因素。2016版《支气管哮喘防治指南》[18]指出，符合典型哮喘的临床症状和体征，并同时具备气流受限客观检查 （支气管舒张试验、支气管激发试验或PEF及其变异率测定）中的任一条， 并除外其他疾病所引起的喘息、气急、胸闷、咳嗽，即可以诊断为BA。在治疗方面[19]，BA目前尚不能完全根治，但可以通过长期使用药物控制其发作次数，改善患者生活质量。西医治疗BA主要用药包括β2受体激动剂、糖皮质激素、茶碱与氨茶碱、抗胆碱类、白三烯受体拮抗剂等，且有最新研究指出吸入皮质类固醇 （ICS） 与 长效β受体激动剂（LABA）联合应用是治疗中度或重度BA的最佳组合。达到扩张支气管，减轻炎症反应与过敏反应的目的。目前抗细胞因子治疗作为支气管哮喘治疗的新方法，特别是基于人性化单克隆抗体、可溶性受体、肽抑制剂等的药物，但是不受控制或控制不力的哮喘仍然是一个问题。

中医将BA归于“哮病”“喘证”的范畴，哮喘发作时“喉中哮鸣有声，呼吸困难，甚则喘息不能平卧”，《医学入门》指出，哮必兼喘，而喘未必兼哮。中医认为，“伏痰”是哮病发作的夙根，正如《丹溪心法》中指出：“哮喘专主于痰”；而人体外感六淫触动伏痰，引起哮喘发作，正如《景岳全书》：“喘有夙根，遇寒即发，或遇劳即发者，亦名哮喘”。“脾为生痰之源，肺为贮痰之器”，哮病的发生发展与肺脾两脏密切相关，属“本虚标实”之证。因此中医治疗哮喘的基本原则[20]为“发时治标，平时治本”，注重“补肺、健脾、化痰”之应用。射干麻黄汤是传统治疗外寒内热哮喘的方剂，擅于温肺化饮、降逆平哮。方中射干清热解毒，合麻黄宣肺平喘、化痰利咽；紫菀、款冬花化痰止咳；细辛、生姜、半夏温肺化饮，大枣、甘草止咳和中，全方以宣肺化痰为主，正对病机。

本研究通过数据收集方法，发现射干麻黄汤中含有有效成分114种，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、木犀草素、豆甾醇、麻黄碱、伪麻黄碱是其中较为重要的有效成分，均有研究证实其对BA有抑制作用。刘清毅[21]证实射干麻黄汤可降低肺组织中白介素5（IL-5）和白介素6（IL-6）的表达，从而抑制支气管哮喘；龚国清等[22]证实了山奈酚、槲皮素能抑制TGF-β1 mRNA的表达，影响气道重塑。洪丽军[23]等证实木犀草素可明显提高血清中IFN-γ及降低白介素4（IL-4）含量，减轻肺组织浸润、管壁及平滑肌厚度。姚凤等验证了[24]β-谷甾醇可抑制TNF-α与白介素6（IL-6）等炎症因子，下调NF-κB活化水平，从而抑制小气道炎症。

本研究KEGG通路富集分析显示，PI3K/AKT信号通路、神经营养素信号通路、FoxO信号通路、Erbb信号通路、趋化因子信号通路、焦点粘附、TNF信号通路等。PI3K信号通路与脂类第二信使相关[25]，使细胞内信号级联通路活化，从而调节T细胞的发育、活化、增殖与分化，而T细胞是哮喘发生过程中重要的炎症细胞。，NF-κB信号通路是BA中研究较多的通路，其与哮喘气道炎症及气 道重塑关系密切[26-27]。而FoxO信号通路、Erbb信号通路、TNF信号通路等均有实验或文献证实其与炎症细胞的生成、分布、浸润有直接或间接关系。这也充分说明了射干麻黄汤在治疗支气管哮喘中多途径的作用特点。

综上所述，本研究通过网络药理学方法对射干麻黄汤治疗支气管哮喘进行了作用机制分析，表明其具有多成分、多靶点、多通路的特点，但由于主要依托于数据库信息，且网络药理学方法主要依托于相互作用关系的数量关系而为引入剂量、剂型、煎药方法等因素，因此对分析结果还存在进一步精确的空间。