稳定高表达MT-1E基因人肾小管上皮HK-2细胞株的构建*

李莎, 罗磊, 黄邵玲, 李继猛, 熊艳艳, 朱雪芹, 谢颖△

1长沙市疾病预防控制中心(湖南长沙 410004)；2湖南师范大学医学院分子流行病学湖南省重点实验室(湖南长沙 410081)

金属硫蛋白(metallothionein protein, MT)的结构在生物进化中高度保守，有4种异构体 MT-1、MT-2、MT-3和 MT-4。MT-1和 MT-2在大多数哺乳动物的内脏器官中广泛存在，尤以肝、肾细胞为主，而且参加其外源化学物代谢功能的调节[1-2]。肾脏是机体代谢解毒的重要器官，其对外界应激或中间代谢产物超过肾脏代偿能力可引起肾功能障碍，如改变肾小球血流速率和流体压力、受损肾脏细胞通过细胞适应和细胞增殖等途径恢复或修复肾单位结构和生物功能等，在此过程中常常伴有金属硫蛋白含量的升高。由于金属硫蛋白的易与二价金属结合的特殊结构和抗氧化作用，使其对细胞产生代偿性保护作用，保护部位可能在细胞核，可以使DNA双链保持稳定，避免形成DNA加和物以减轻氧化损伤，金属硫蛋白比谷胱甘肽具有抗核氧化作用更为明显[3]。据报道金属硫蛋白除可保护细胞拮抗氧化损伤外，可能还参与机体微量元素的代谢和重金属解毒等作用[4]。为了进一步研究金属硫蛋白在外源化学物对肾脏不良生物学作用的保护机制，本研究2019年1月至2021年10月主要使用LV5(EF-1aF/GFP&Puro)质粒构建稳定高表达MT-1E的人肾小管上皮HK-2细胞株，为后续开展金属硫蛋白的生物学功能研究提供分子水平的实验工具。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒 质粒购自上海吉玛制药技术有限公司，载体为LV5(EF-1aF/GFP&Puro)质粒，克隆位点NotI/BamHI，含绿色荧光蛋白EGFP。HK-2细胞采用含10%胎牛血清和1%链霉素-青霉素双抗的DMEM高糖培养基培养，细胞购自中国科学院上海细胞库。细胞常规培养使用含10% FBS的DMEM培养基(含1.5 mg/L Glutamine, 100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin)，37℃ 5% CO2饱和湿度培养箱中培养。本次研究经长沙市疾病预防控制中心伦理委员会讨论审核通过(批准号：CSCDC-2021-09)。

1.2 试剂与仪器 DMEM培养基(Gibco)、胎牛血清FBS(BI)、PBS(Life Science Products & Services)、Trypsin-EDTA Solution(Hyclone)、Anti-MT-1E抗体(ab193623)、6孔板(Corning)、24孔板(Corning)、6 cm & 10 cm培养皿(Corning)、过表达病毒液(吉玛基因)、RNAi-Mate转染试剂(吉玛基因)、Lentivirus-NC病毒液(吉玛基因)、Puromycin(Merck)、Cat# GMRS-001实时荧光定量通用试剂(吉玛基因)、ABI stepone plus 实时荧光定量PCR仪(LIfe)、FRESCO17高速冷冻离心机(Thermo)、NanoDrop2000分光光度计(Thermo)、Eclipse TS100-F倒置显微镜(Nikon)、Eclipse Ti-u倒置荧光显微镜(Nikon)、Multimode reader2300多功能酶标仪(PerkinElmer)、Milli-Q纯水仪(Millipore)。

1.3 细胞侵染效率检测 将生长状态良好的HK-2细胞接种于24孔板，37℃ 5% CO2常规培养过夜；取病毒液按1∶5、1∶10、1∶20与培养基混合稀释，总体积500 μL；弃去上层培养基，加入病毒梯度稀释液，37℃ 5% CO2常规培养24 h；弃去病毒梯度稀释液，加入新鲜培养基，37℃ 5% CO2常规培养72 h，于荧光倒置显微镜下观察并记录结果。

1.4 细胞浸染实验 将生长状态良好的HK-2细胞接种于6孔板，37℃ 5% CO2常规培养过夜；取实验用病毒液按1∶10与培养基混合稀释；弃去上层培养基，加入实验用病毒稀释液，37℃ 5% CO2常规培养24 h；弃去病毒稀释液，加入新鲜培养基，37℃ 5% CO2常规培养。

1.5 最小致死浓度检测 将生长状态良好的HK-2细胞接种于24孔板，37℃ 5% CO2常规培养过夜；用完全培养基稀释嘌呤霉素(puromycin)至4 μg/mL，两倍倍比稀释，最小浓度至0.25 μg/mL，37℃ 5% CO2常规培养7 d，于倒置显微镜下观察并记录结果。

1.6 稳定过表达筛选及鉴定 根据最小致死浓度检测结果，在培养基加入4 μg/mL 的嘌呤霉素(puromycin)，37℃ 5% CO2常规培养，于荧光倒置显微镜下观察并记录结果；引物设计序列如下，MT-1E，h-MT-1E-fo1，TCAGGTTGGGAGGGAACTCAA，h-MT-1E-re1，GAAAGCCTGGAGAGGGAATGA，扩增长度为101 bp，HGAPDH，HGAPDH-FO，CATGAGAAGTATGACAACAGCCT，HGAPDH-RE，AGTCCTTCCACGATACCAAAGT，扩增长度为113 bp；mRNA 逆转录反应体系，RNA 模板、无RNase水、随机引物 N6[100 μmol/L]、5× 逆转录缓冲液、dNTP[10 mmol/L]、MMLV 逆转录酶(200 U/μL)、RNasin[40 U/μL]；实时荧光定量反应体系，2×Real-time PCR Master Mix、primer set(5 μmol/L)、ROX校准染料(50×)1、rTaq DNA 聚合酶(5 U/μL)、Template、ddH2O；实时荧光定量反应条件，逆转录阶段(70℃ 5 min、37℃ 60 min、85℃ 10 min、4℃)，mRNA实时荧光定量阶段(94℃ 3 min、94℃ 12 s、62℃ 30 s、72℃ 30 s，40个循环)。阴性对照细胞组为转入空载质粒HK-2细胞，高表达慢病毒稳筛细胞组为高表达MT-1E细胞组利用慢病毒载体转入HK-2细胞组。对转染成功后的肾小管上皮HK-2细胞提取总蛋白，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白印迹分析鉴定。

1.7 统计学方法 利用Odyssey软件分析不同分组蛋白印迹灰度值，各蛋白条带灰度值采用均数±标准差表示，采用SPSS 16.0统计软件进行，组间比较采用t检验，检验水准为α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 浸染效率检测 通过明光视野和荧光视野200×镜下观察，发现病毒液与培养基1∶10稀释侵染72 h，细胞侵染效率可大于80%，见图1。

注：A：空白细胞；B：1∶5稀释浸染；C：1∶10稀释浸染；D：1∶20稀释浸染

2.2 细胞浸染实验 病毒液与培养基1∶10稀释侵染72 h后，在明光视野和荧光视野100×镜下观察浸染实验细胞状态，发现细胞状态可达到后续实验的要求。见图2。

注：A：空白细胞状态；B：浸染对照状态；C：浸染高表达状态

2.3 最小致死浓度检测 由图3可见，经过0.25、0.5、1、2、4 μg/mL梯度浓度摸索，镜下观察细胞状态分析嘌呤霉素(puromycin)最小致死浓度为4 μg/mL，可用此浓度进行细胞筛选以开展后续实验。

注：A：空白细胞；B：0.25 μg/mL浓度；C：0.5 μg/mL浓度；D：1 μg/mL浓度；E：2 μg/mL浓度；F：4 μg/mL浓度

2.4 质粒DNA测序及高表达细胞株鉴定 RT-PCR电泳结果显示GAPDH、MT-1E基因PCR产物大小正确，无杂带说明引物特异性好(图4)，测定A260/A280比值阴性对照细胞组(2.025～2.033)和高表达慢病毒稳筛细胞组(1.968～1.972)的OD值均在1.9～2.2之间，表明提取过程中没有蛋白污染，可用于后续试验。对转入MT-1E基因的质粒进行测序鉴定，通过基因序列比对，测序结果与目的序列一致，见图5。

注：A：GADPH组；B：MT-1E组

图5 MT-1E基因测序图

明光视野和荧光视野100×镜下可见，高表达慢病毒稳筛细胞组形态如图6所示。Westem blot结果显示，对照组MT-1E/GAPDH蛋白表达水平为0.26±0.09，高表达MT-1E组为0.71±0.21。高表达慢病毒稳筛细胞组的MT-1E蛋白相对表达量与对照组比较，差异有统计学意义(t=15.89，P=0.016)，表明高表达MT-1E的LV5(EF-1aF/GFP & Puro)质粒明显增加MT-1E蛋白表达量，见图7。

3 讨论

金属硫蛋白是富含半胱氨酸残基的小分子量金属结合蛋白，其主要的生物学功能之一是与重金属在机体内的代谢转运相关，从而提高机体对重金属毒性的代偿能力，如破壁灵芝孢子粉等可诱导金属硫蛋白表达，具有拮抗大鼠发生镉中毒且降低镉暴露肝脏毒性的功效[5]。一些金属离子(如Cd2+、As3+等)可促进细胞内金属硫蛋白的表达增加，且与外源性化学物所致细胞氧化损伤修复相关[6]。有学者[7]通过分子生物信息学的方法利用微阵列矩阵分析，可见长期吸烟也可能会引起气道金属硫蛋白表达上升，金属硫蛋白mRNA序列中包含“CTCCTGC”片段，可与has-miR-4722-5p区域匹配。李柯桦等[8]通过2015—2018年的队列研究，利用logistic回归模型分析暴露于铅镉锰等金属环境下的风险因素，结果显示金属硫蛋白可能与机体重金属解毒和自由基清除等生物学功能均有关。锌可对镉引起的巨噬细胞毒性起到拮抗作用，其分子机制是通过金属硫蛋白的合成表达调节金属转录因子，进而与镉性巨噬细胞毒性产生联合毒性作用，期间常伴有形态学和超微结构的改变[9]。通过超微结构的观察，发现机体表达的金属硫蛋白具有20个半胱氨酸配体的互补物，且以类似四面体配位几何结构可结合多达7种二价金属离子，尽管金属硫蛋白分子序列相对保守，但其与金属离子结合后的可表现出易于结合的生物学功能[10]。

慢病毒载体是较常用的重组逆转录病毒载体，一般安全性较高的载体会加入一段反式作用因子修饰，以避免子代病毒的自我复制。本研究所使用的LV5(EF-1aF/GFP&Puro)质粒载体，对5＇和3＇LTR分别进行了删除改造，使载体复制不具有增强活性。尽管如此改进后的慢病毒载体安全性有所提高，但实验过程中仍应尽可能在BSL2级的生物安全柜中进行，且实验过程中应严格按照规范操作，避免慢病毒载体接触到口鼻眼等身体开放性区域。实验操作后实验器具均应高温灭菌消毒，实验台面可用70%酒精擦拭，有液滴附着的台面，还应使用0.6%次氯酸钠溶液浸泡1 h以上。嘌呤霉素是一种常见的蛋白质合成抑制剂，其对蛋白质翻译过程有生物学作用，类似于tRNA分子末端结构能够将共价连接到核糖体多肽链上以终止翻译过程[11]。针对嘌呤霉素细胞抗性的编码位点主要是嘌呤霉素N-乙酰转移酶的Pac基因位点，当含有Pac基因的质粒或转染细胞表达Pac基因后，可产生实验所需抗性进而用于细胞筛选。

利用分子生物学手段构建高表达某个基因的细胞株是研究基因生物学功能的一种常用方法，黄晓等[12]使用嘌呤霉素筛选阳性克隆，构建高表达miR-17-92的小鼠白血病L1210细胞，其转染效率高，目的基因表达稳定。为了能够确保转染效率，采用酶切及测序的方法检测构建的质粒是否符合后续实验的要求也是构建高表达细胞株必不可少的一环[13]。熊永福等[14]认为传统的基因过表达技术以理化方法为主，其对细胞株损伤较重，适用范围较小且不适宜用于稳转株的制备，而以慢病毒转染为代表的生物载体体系则可最大限度减少外源基因片段对细胞自身遗传相关特性的影响。本研究使用LV5(EF-1aF/GFP&Puro)质粒载体，利用嘌呤霉素筛选，构建稳定高表达MT-1E的方法是可行的。许淑文等[15]使用GV143质粒载体将TGF-β1基因整合至心肌H9c2细胞，使用荧光显微镜观察可见转染组较对照组mRNA水平显著升高。本研究通过质粒转染技术，将MT-1E转染至人肾小管上皮HK-2细胞株中，并使用嘌呤霉素对转染细胞进行筛选，荧光显微镜下观察转染效果，蛋白免疫印迹技术进行稳转株的表达鉴定。实验结果证明经过转染的HK-2细胞株可MT-1E基因蛋白表达量升高，可用于后续肾小管上皮细胞中MT的生物学功能实验。

利益相关声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献说明：李莎、黄邵玲负责论文撰写及修改；李继猛负责提出工作设想及方案；罗磊、熊艳艳、朱雪芹负责实验过程；谢颖负责指导论文写作和关键实验技术。