电针对帕金森病大鼠海马组织MAP4K3/MKK4/JNK通路的影响

朱福连，梁培日，张创良

(海南省干部疗养院，海南省老年病医院 内科， 海南 海口 571100)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是常见于中枢神经系统的慢性退行性疾病之一，其临床症状主要表现为肌强直、静止性震颤、姿势平衡障碍和运动迟缓等特征性运动症状，但也有精神障碍、认知障碍等非运动伴随症状，严重影响患者生存质量[1-2]。目前临床缺乏根治PD的特效药物，但在神经系统疾病治疗方面，越来越多的研究热点集中到了中医领域[3]。针灸作为中医领域传统的治疗方式，已广泛应用于改善神经系统疾病，如延缓阿尔茨海默病进展[4-5]。近年来，针灸在PD疾病治疗中亦得到很好的应用，但由于针灸作用靶点众多，针灸治疗PD疾病的机制尚未完全明确[6-7]。丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶3(Mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 3，MAP4K3)在肿瘤中发挥抑癌作用，近年来发现其可调控丝裂原活化蛋白激酶激酶4(Mitogen-activated protein kinase kinase 4，MKK4)/c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)在脑出血大鼠神经元凋亡过程中发挥重要作用[8]，但在PD疾病中尚无研究。本研究将观察电针对PD大鼠海马组织MAP4K3/MKK4/JNK通路的影响，以期探讨电针治疗PD的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠，体质量为(200±10)g，SPF级，由浙江维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK(浙)2019-0001。

1.1.2 试剂与仪器 6-OHDA(货号：S30042)购自上海源叶生物科技有限公司；HE试剂盒(货号：AR1180)购自武汉博士德生物工程有限公司；TUNEL试剂盒(货号：QIA33)购自美国Sigma-Aldrich；兔源MAP4K3抗体(货号：orb588710)购自Biorbyt；兔源p-MKK4抗体、兔源MKK4抗体、兔源p-JNK抗体、兔源JNK抗体、兔源Bax抗体、兔源cleaved caspase-3抗体、兔源GAPDH抗体、羊抗兔IgG(货号：ab278619、ab33912、ab124956、ab179461、ab32503、ab32042、ab181602、ab6721)购于美国Abcam；电针治疗仪(G6805-2A型)购于上海华谊仪器制造厂；BX53显微镜购自日本奥林巴斯；Ti2荧光显微镜购自日本Nikon；GS-800凝胶成像仪购自美国Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1 PD大鼠造模 采用6-OHDA双靶点注射法复制PD模型大鼠[9]。大鼠适应性喂养1周后，按0.35 g/kg给予大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉、固定，用脑立体定位仪定位黑质致密部及中脑腹侧被盖区。颅顶常规备皮，剪开头皮，使用微量注射器在以上两点缓慢注射1 μL 4 μg/μL 6-OHDA，注射后留针5 min再缓慢退针，缝合切口，腹腔注射青霉素预防感染。造模1周后，向造模大鼠进行0.5 mg/kg阿扑吗啡腹腔注射，诱发其旋转，记录30 min内大鼠的旋转次数，旋转次数大于210圈的大鼠即为PD造模成功的大鼠。

1.2.2 大鼠分组及电针干预 将PD造模成功的大鼠分为PD模型组及电针干预组，每组16只，另取16只未经造模的大鼠为对照组。电针干预组大鼠参照实验动物针灸穴位图谱定位百会穴、风府穴和太冲穴[10]，在以上穴位进针并连接电针治疗仪治疗40 min，设置电流频率2 Hz，强度0.6 mA，以大鼠头部、脚趾发生微颤为度，每日电针治疗1次，治疗4周结束。对照组、PD模型组大鼠每日相同时间抓取在实验木板上固定40 min。

1.2.3 大鼠记忆、行为学功能测试 末次治疗结束后次日，采用Morris水迷宫实验及旷场实验测试各组大鼠记忆功能及行为学功能。①Morris水迷宫实验：准备直径1 m的圆形水池，正中立有直径15 cm的圆柱形平台，池内放21℃左右的水，水面高出平台约2 cm。提前训练4 d，每日将大鼠从不同方向面向池壁放入水中，记录大鼠找到平台的时间，即逃避潜伏期，60 s内仍未找到平台的大鼠，可用导向杆做适当引导，并使大鼠停留在平台上10 s以强化记忆。第5天撤除平台，保持大鼠从同一位置放入水中，记录其到原平台位置所用时间(逃避潜伏期)及在原平台位置停留的时间(原平台停留时间)。②旷场试验：准备100 cm×100 cm×50 cm的旷场反应箱，底部用25 cm×25 cm格子标注，上方悬挂可观察整个反应箱底部的摄像头，置于安静、昏暗的环境，将大鼠放入中间的格子，待其适应10 min后，记录大鼠在5 min内的运动情况，统计水平运动得分(双前肢沿直线每行走10 cm或穿过1格记1分)及垂直运动得分(双前肢离开地面到放下记1分)。

1.2.4 大鼠海马组织病理学检查 大鼠进行记忆、行为学功能测试后，每组取8只断头处死，分离脑中海马组织。将海马组织放入4%多聚甲醛溶液中固定，经脱水透明后，使用石蜡包埋，切片(5 μm)，烘干后脱蜡、水化，使用HE试剂盒进行染色，脱水、透明后封片观察。

1.2.5 大鼠海马组织中细胞凋亡情况检测 取海马组织切片，TUNEL法检测组织中细胞凋亡情况。切片常规脱蜡、水化，浸入0.85% NaCl溶液中5 min洗脱样品，PBS洗涤。用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤。滴加蛋白酶K孵育15 min、4%多聚甲醛固定5 min进行通透，PBS洗涤。滴加平衡缓冲液放置10 min预平衡。用dUTP标记的rTdT孵育缓冲液覆盖组织，于湿盒中37℃避光孵育60 min，后放入2X SSC静置15 min终止反应，PBS洗涤。DAPI染核，封片，荧光显微镜观察，计算细胞凋亡率。

1.2.6 大鼠海马组织中MAP4K3/MKK4/JNK通路相关蛋白表达检测 将剩余8只大鼠断头处死，分离脑中海马组织，RIPA裂解液提取其中蛋白，取40 μg样本沸水浴变性，用10% SDS-PAGE分离蛋白，转移到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭膜1 h，将PVDF膜与一抗(兔源MAP4K3抗体、兔源p-MKK4抗体、兔源MKK4抗体、兔源p-JNK抗体、兔源JNK抗体、兔源Bax抗体、兔源cleaved caspase-3抗体、兔源GAPDH抗体)4℃孵育过夜，在室温下与羊抗兔二抗孵育1 h，化学发光法发光，凝胶成像仪采集图像，分析条带灰度。

2 结果

2.1 各组大鼠记忆、行为学功能 与对照组相比，PD模型组大鼠逃避潜伏期显著延长，原平台停留时间显著缩短(P<0.05)，水平运动得分及垂直运动得分显著降低(P<0.05)；与PD模型组相比，电针干预组大鼠逃避潜伏期显著缩短，原平台停留时间显著延长(P<0.05)，水平运动得分及垂直运动得分显著升高(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠逃避潜伏期、原平台停留时间、水平运动得分及垂直运动得分比较

2.2 各组大鼠海马组织病理变化 HE染色可见，对照组海马区神经元排列规律，胞核形态规则；PD模型组海马区神经元稀少，排列紊乱、疏松，细胞核可见固缩、溶解；与PD模型组相比，电针干预组海马区神经元病理改变轻微，仅存在少量胞核固缩、溶解(见图1)。

A:对照组； B:PD模型组；C:电针干预组;×200。图1 HE染色观察海马组织病理变化

2.3 各组大鼠海马组织中细胞凋亡情况 与对照组相比，PD模型组大鼠海马组织中细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与PD模型组相比，电针干预组大鼠海马组织中细胞凋亡率显著降低(P<0.05，见图2、表2)。

A:对照组；B:PD模型组；C:电针干预组;×200。图2 TUNEL染色观察海马组织中细胞凋亡

表2 各组大鼠海马组织中细胞凋亡率比较

2.4 各组大鼠海马组织中MAP4K3/MKK4/JNK通路相关蛋白表达情况 与对照组相比，PD模型组大鼠海马组织中MAP4K3/GAPDH、p-MKK4/MKK4、p-JNK/JNK蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与PD模型组相比，电针干预组大鼠海马组织中MAP4K3/GAPDH、p-MKK4/MKK4、p-JNK/JNK蛋白表达水平显著降低(P<0.05，见图3、表3)。

图3 各组大鼠海马组织中MAP4K3/MKK4/JNK通路相关蛋白表达情况

表3 各组大鼠海马组织中MAP4K3/GAPDH、p-MKK4/MKK4、p-JNK/JNK蛋白表达水平比较

2.5 各组大鼠海马组织中凋亡相关蛋白表达情况 与对照组相比，PD模型组大鼠海马组织中Bax、cleaved caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与PD模型组相比，电针干预组大鼠海马组织中Bax、cleaved caspase-3蛋白表达水平显著降低(P<0.05，见图4、表4)。

图4 各组大鼠海马组织中凋亡相关蛋白表达情况

表4 各组大鼠海马组织中Bax、cleaved caspase-3蛋白表达水平比较

3 讨论

PD是常见于老年人群的慢性神经系统退行性疾病，近年来随着社会老龄化程度的逐渐加剧，其发病率逐渐升高，不仅从身体、心理层面上给患者带来痛苦，也给其家属及社会增添了沉重的负担[11-12]。6-OHDA注射诱导是一种目前公认的PD造模方法[13]，本研究采用该方法建立PD大鼠模型，以阿扑吗啡诱发旋转超过210圈/30 min为造模成功，可见大鼠逃避潜伏期延长，原平台停留时间缩短，水平运动得分及垂直运动得分降低，说明大鼠学习记忆、认知及运动能力均降低。HE染色及TUNEL染色可见PD大鼠海马区细胞凋亡率升高，神经元稀少且排列紊乱、疏松，细胞核出现固缩、溶解，说明PD发病后海马组织已发生病理学改变，神经元损伤严重。

大量研究表明，针灸刺激穴位可以改善PD患者症状，提高认知、运动功能[14-15]。马骏等[10]发现，采用电针刺激PD大鼠风府穴、太冲穴，可减少多巴胺能神经元凋亡。于建军[16]研究显示，电针刺激百会穴、印堂穴、太冲穴和三阴交穴，可改善帕金森抑郁大鼠的行为学功能。王述菊等[17]研究显示，艾灸风府、关元、足三里穴可治疗PD大鼠。百会穴是脑病的特效穴，可改善脑组织血液循环，增强记忆力，发挥脑保护作用[18]。本研究通过电针刺激PD大鼠的百会穴、风府穴和太冲穴的治疗结束后，PD大鼠逃避潜伏期缩短，原平台停留时间延长，水平运动得分及垂直运动得分升高，提示电针治疗可明显改善PD大鼠的认知功能、运动功能。HE染色及TUNEL染色可见PD大鼠海马组织中细胞凋亡率降低，病理改变减轻，同时海马组织中Bax、cleaved caspase-3蛋白水平降低，提示电针治疗可降低凋亡相关因子表达，减轻PD发病带来的海马神经元损伤，以致与该区域相关的认知和运动功能得以提高。

MKK4是MAPK激酶，可激活JNK通路，进而参与神经退行性疾病的发展[19]。Wang等[20]研究发现，通过抑制MKK4/JNK/c-Jun信号通路激活，可对PD小鼠发挥神经保护作用。MAP4K3是STE20样丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员，在肿瘤中具有抑癌作用。杨慧等[8]研究发现，通过抑制MAP4K3/MKK4/JNK信号通路，可减少脑出血大鼠神经元凋亡。本研究显示，建立PD模型后，大鼠海马组织中MAP4K3蛋白及MKK4、JNK蛋白的磷酸化水平升高，电针干预后，PD大鼠海马组织中MAP4K3蛋白及MKK4、JNK蛋白的磷酸化水平降低，提示MAP4K3/MKK4/JNK信号通路激活参与PD发病过程，而电针干预可抑制MAP4K3/MKK4/JNK信号通路激活，并进一步推测MAP4K3/MKK4/JNK信号通路亦是电针治疗PD的干预靶点之一。

综上所述，电针可抑制PD大鼠海马组织中MAP4K3/MKK4/JNK通路的激活，保护海马神经元，提高认知与运动功能。