茅台酒糟中生育酚类、甾醇类和三萜类物质的检测及溯源

胡光源，陈宗校，杨理章，李永素，王和玉，王 莉*

（1.贵州茅台酒股份有限公司，贵州 遵义 564501；2.中国贵州茅台酒厂（集团）有限责任公司，贵州 遵义 564501）

酒糟是粮食用于酿酒后残留的固态混合物，是白酒行业最主要的副产物。除水分外，酒糟中含有丰富的淀粉、粗蛋白、粗脂肪、氨基酸和微量元素[1]，具有潜在的研究和应用价值。然而目前酒糟的处理和应用主要集中于提取蛋白质、动物饲料、丢糟酒、调味品、纤维素、食用菌培养基、乙醇燃料等的粗加工[2]及生产有机肥[3]等方面，关于酒糟中化学成分及其生物学功能的研究报道较少，通过对酒糟中生物活性物质的发掘和研究，可提高酒糟的二次利用价值，实现利润最大化。

生育酚和生育三烯酚统称VE，是人体必需的脂溶性维生素[4-5]。VE是一种强有效的抗氧化剂，具有提高机体免疫力、延缓衰老、神经保护、抑制胆固醇合成及肿瘤细胞生长、预防动脉硬化和心脑血管疾病等多种生理功能[6-7]。甾醇是一类以环戊烷多氢菲为骨架[8-9]，与胆固醇结构相似，类似于维生素原性质的活性物质[10]，目前研究发现，甾醇具有降低胆固醇[11-12]、抗菌[8]、抗炎[11,13]、镇痛[11]、抗癌[14]、抗肿瘤[15]、免疫调节[16]、抗氧化[17-18]、预防心血管疾病[19]、抑制乳腺增生[20]等多种生物学功能；三萜类化合物是一类基本母核由30个碳原子组成的萜类化合物，是一类重要的中药化学成分，这类化合物具有溶血[21]、抗病毒[22]、降低胆固醇[23]、神经保护[24]等活性。这3类活性物质均在医药、食品、化妆品、化工、纺织等行业有广阔的应用前景。

本研究拟建立超声辅助提取结合气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法分析酒糟中生育酚类、甾醇类和三萜类生物活性物质的方法，在茅台酒糟中发现生育酚类、甾醇类和三萜类物质共18种，可为酒糟中生物活性物质的高效利用和开发奠定基础，同时也为酒糟的高附加值利用提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茅台酒糟、茅台大曲，茅台酒用高粱和小麦，均由贵州茅台酒股份有限公司提供。

α-生育酚（纯度95.5%）、γ-生育酚（纯度≥96%）、麦角甾醇（纯度≥95%）、豆甾醇（纯度95%）、羊毛甾醇（纯度≥93%） 美国Sigma公司；胆甾烷醇（纯度≥98%） 美国Alfa Aesar公司；菜油甾醇（纯度≥99%） 百灵威科技有限公司；正丁醇、乙醚（均为分析纯），丙酮（色谱纯）国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙醇、二氯甲烷、正己烷（均为色谱纯） 美国Tedia公司；乙腈、乙酸乙酯（均为色谱纯） 德国Merck公司。

1.2 仪器与设备

7890A/5975C GC-MS联用仪、HP-5毛细管色谱柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent公司；Mikro 220R型离心机 德国Hettich公司；8800超声波清洗机 美国Branson公司；KS 260摇床 德国IKA公司；MS1602TS电子天平 瑞士梅特勒公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

称取5.00 g样品（酒糟、大曲、高粱或小麦）于50 mL离心管中，加入适量提取溶剂，450 r/min摇床振荡15 min混匀，超声提取5 min，5 000 r/min离心5 min分层，上清液经0.45 μm滤膜过滤，4 ℃保存待测。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：HP-5毛细管色谱柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：初始温度60 ℃，以100 ℃/min升至300 ℃，保持16 min；采用恒流模式，载气（He）流速1.0 mL/min，不分流进样，进样量1 μL，进样口温度300 ℃。

1.3.3 质谱条件

电子电离源：电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃。定性采用全扫描模式，质量扫描范围m/z35～500；溶剂延迟：5.0 min；定量采用选择离子扫描模式（single ion monitor，SIM），每个化合物选择1个定量离子，2～3个定性离子。

1.3.4 定量方法

用正丁醇配制7种标准品的混合系列标准溶液，按照1.3.2、1.3.3节的方法进样分析，以质量浓度-峰面积建立标准曲线；将色谱峰信噪比大于3的质量浓度确定为检出限，信噪比大于10确定为定量限[25]。因本研究的重点是对酒糟中发现的生物活性物质进行定性和溯源分析，因三萜类物质含量较低、且标准品价格昂贵，在不影响生物活性物质溯源分析的前提下，只对部分化合物进行了精确定量。

2 结果与分析

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 提取剂的选择

不同溶剂对样品中化学成分的提取效率不同，本研究按照1.3.1节方法，在提取剂体积为10 mL及其他条件恒定下，对比乙酸乙酯、丙酮、乙醚、正己烷、正丁醇、乙醇、二氯甲烷、乙腈、甲醇对酒糟中生育酚类和甾醇类物质的提取效果，为了简化，以7种物质（标准品）的总峰面积作为衡量指标。如图1所示，极性溶剂的提取效果整体比非极性溶剂好，其中极性溶剂正丁醇的提取效果最好，乙酸乙酯和丙酮的提取效果相当，而非极性的溶剂乙醚和正己烷的提取效果均较差，因此选择正丁醇作为提取剂。

图1 提取溶剂对提取效果的影响Fig.1 Effect of solvent type on extraction efficiency

2.1.2 提取剂用量的优化

在其他条件恒定下，考察料液比对提取效果的影响，如图2所示。采用不同料液比对目标化合物进行提取时，提取效率会随着料液比的减小而增加（提取效率/%=酒糟中7种定量化合物提取一次的总含量/酒糟中7种化合物的实际总含量×100），在料液比为1∶3（g/mL）时，提取效率最高，达到80%，然后趋于平衡，在料液比为1∶4和1∶5（g/mL）时，提取效率均保持在80%左右。尽管在料液比为1∶1（g/mL）时，提取效率只有45%左右，但因酒糟中目标化合物的含量较低，为提高检出限、定量的准确性、方法的经济性与环保性，最终选择目标化合物的峰面积最高，提取溶剂为5 mL，作为最优提取剂用量，即料液比为1∶1（g/mL）。

图2 料液比对提取效果的影响Fig.2 Effect of solid-to-solvent ratio on extraction efficiency

2.2 茅台酒糟中生育酚类、甾醇类和三萜类物质的定性分析

采用上述优化的条件对酒糟进行提取并经GC-MS分析，通过质谱信息和保留指数比对定性，共定性茅台酒糟中5种生育酚类、9种甾醇类和4种三萜类生物活性物质，见表1。

表1 茅台酒糟中生育酚类、甾醇类和三萜类物质Table 1 Mass spectrometric parameters and retention indices of tocopherols, sterols and triterpenoids in Moutai distiller’s grains

文献报道此类物质均具有一定的生物活性功能，生育酚和生育三烯酚是VE的两大亚族，均存在α、β、γ和δ四种同分异构体[26]，其中4种生育酚均具有很强的抗氧化活性[27]，生育三烯酚则具有抗氧化、降胆固醇、抗炎和抗肿瘤等多种生物学活性[28]，其中在茅台酒糟中发现的γ-生育三烯酚可以选择性抑制结肠癌的发生发展[29]；麦角甾醇是决定细胞流动性的真菌细胞膜的重要组成部分，其生物合成途径是许多抗真菌剂的靶标[30-31]；菜油甾醇是重要的制造药物类固醇的前体[32]；豆甾醇具有免疫调节作用，在过敏性皮肤病的治疗方面具有巨大潜力[33]；γ-谷甾醇具有降血脂作用[34]；羊毛甾醇是一种两亲分子，可有效阻碍晶状体蛋白质的聚集[35]，并具有抗生物膜活性和抗群体感应活性的功能[36]；环阿屯醇具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗阿尔茨海默病等多种活性[37]，β-扶桑甾醇氧化物具有一定的抗疟疾活性[38]；属于三萜类的羽扇豆醇和5-麦谷蛋白-3-醇具有一定的抗癌活性[39]和良好的抗炎活性[40]；24-亚甲基环阿屯醇具有抗糖尿病作用[41]；乙酸羽扇醇酯具有与羽扇豆醇相似的生物活性和更高的生物利用度[42]，可促进皮肤修复，作为活性物质用于治疗皮肤灼伤[43]。因此，本研究在茅台酒糟中发现18种生物活性物质，不仅提高了对茅台酒糟及茅台酒中化学成分的认识，更为酒糟资源化利用提供了新思路。

2.3 茅台酒糟中生育酚类和甾醇类物质的定量分析2.3.1 方法评价

按照1.3节方法、2.1节优化确定的条件及2.2节中各物质的特征离子，对其中的7种化合物进行定量，具体结构见图3，并对同一个酒糟样品进行连续6次相互独立的测定，通过相对标准偏差考察方法的精密度；通过向样品中添加适量标准品，并在优化的条件下回收提取，测定加标回收率（加标回收率/%=（加标酒糟提取的总含量-空白酒糟提取的总含量）/（加标含量×单次提取率）h100），考察方法准确度；将信噪比大于3的质量浓度确定为检出限，信噪比大于10确定为定量限。

图3 7种定量物质的化学结构Fig.3 Structures of 7 quantitatively analyzed substances

如表2所示，7种目标物标准曲线线性良好，R2均大于0.99；在重复性条件下连续进样分析，酒糟中7种目标物质的相对标准偏差均不高于6.40%，方法精密度较高；平行测定酒糟样品和向其中加入已知浓度待测组分的加标样品，计算其加标回收率，加标回收率在88.9%～102.3%之间，加入的被测组分量可定量回收，方法准确度较高。

表2 方法评价指标Table 2 Analytical figures of merit of the developed method

2.3.2 酒糟中生育酚类、甾醇类物质的含量

酒糟中目标物质含量与第1次提取的量及提取率有关，本研究按上述优化确定的方法测定了酒糟提取液中目标物质的含量，并对同一酒糟样品进行反复提取，直至提取液中检测不到任何目标物质。由于正丁醇对不同化合物的提取效果不同，具体提取次数和提取结果如表3所示。酒糟经过3次提取后，仪器基本检测不到胆甾烷醇和羊毛甾醇两个化合物；而γ-生育酚、α-生育酚、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇需提取8次，仪器才基本检测不到。根据各提取液中目标物的含量计算第1次提取率和在酒糟中的含量，7个目标化合物的首次提取率在34.33%～58.74%，茅台酒糟中7种生物活性物质含量为0.85～133.09 mg/kg。

表3 酒糟中生育酚类和甾醇类物质的提取结果Table 3 Effect of number of extraction cycles on contents of tocopherols and sterols in Moutai distiller’s grains

2.4 茅台酒糟中生育酚、甾醇类和三萜类物质的来源

茅台酒糟以高粱为主要原料，经过多轮次蒸煮和发酵，每个轮次加入适量大曲（以小麦为主要原料生产的高温大曲），因此茅台酒糟中的生育酚类、甾醇类和三萜类物质可能来源于高粱、大曲（小麦）或生产过程的生化反应。

表5 B班酒糟中生育酚类、甾醇类和三萜类物质含量跟踪分析Table 5 Traceability analysis of tocopherols, sterols and triterpenoids contents in the distiller’s grains from class B

为研究茅台酒糟中生育酚类、甾醇类和三萜类物质的来源，跟踪分析酒糟中此类物质在1个轮次生产周期内的含量，表4、5分别为两个不同班组各1个窖的样品跟踪分析结果，δ-生育酚在6轮次生产前后含量升高22.2%～32.9%，主要来自固态蒸馏过程（表4、5中“拌壳～下甑”），其他物质在1个轮次生产周期内的含量变化均较小，即生产过程的生化反应对此17种物质的贡献小，可能主要来源于酿酒原料，即高粱或（和）大曲（小麦）。

表4 A班酒糟中生育酚类、甾醇类和三萜类物质含量跟踪分析Table 4 Traceability analysis of tocopherols, sterols and triterpenoids contents in distiller’s grains from class A

为此，进一步分析生育酚类、甾醇类和三萜类物质在原料和大曲中的含量如表6所示，δ-生育酚在小麦和大曲中未检出，在高粱中的含量高于酒糟，综合确定其来自高粱和蒸馏过程；环阿屯醇、羽扇豆醇和5-麦谷蛋白-3-醇在小麦和大曲中未检出，γ-生育酚和乙酸羽扇醇酯的含量为高粱＞酒糟＞小麦、大曲，此5种物质主要来自高粱；胆甾烷醇、β-生育酚、γ-生育三烯酚的含量为小麦＞大曲＞酒糟＞高粱，主要来自小麦；麦角甾醇在高粱和小麦中的含量均显著低于酒糟，但在大曲中的含量较高，该物质主要来自制曲生产过程；β-扶桑甾醇氧化物在小麦中的含量高于高粱，但低于酒糟，而大曲中的含量显著较高，该物质主要来自小麦和制曲生产过程；24-亚甲基环阿屯醇在高粱和小麦中的含量略低于酒糟，大曲中的含量较高，主要来自高粱、小麦和制曲生产过程；α-生育酚、菜油甾醇、豆甾醇、羊毛甾醇、γ-谷甾醇、豆甾-5,24(28)-二烯-3-醇来自高粱和小麦的共同贡献。

表6 原料和大曲中生育酚类、甾醇类和三萜类物质的含量Table 6 Tocopherols, sterols and triterpenoids contents in raw materials and Daqu

3 结 论

建立了酒糟中生育酚类、甾醇类和三萜类物质的分析方法，实现茅台酒糟中5种生育酚类、9种甾醇类和4种三萜类生物活性物质的定性及其中7种物质的定量分析，完成茅台酒糟中上述18种生物活性物质的溯源分析，确定了环阿屯醇、羽扇豆醇、5-麦谷蛋白-3-醇、γ-生育酚、乙酸羽扇醇酯主要来自高粱，胆甾烷醇、β-生育酚、γ-生育三烯酚主要来自小麦，δ-生育酚主要来自高粱和蒸馏过程，β-扶桑甾醇氧化物主要来自小麦和制曲生产过程，麦角甾醇主要来自制曲生产过程，24-亚甲基环阿屯醇主要来自高粱、小麦和制曲生产过程，α-生育酚、菜油甾醇、豆甾醇、羊毛甾醇、γ-谷甾醇、豆甾-5,24(28)-二烯-3-醇来自高粱和小麦的共同贡献。