鲈鱼干加工过程中热处理及内源酶对风味形成的影响

刘夏磊，刘芯如，王雨恬，魏好程,2,3,4,5，李利君,3,4，倪 辉,2,3,4,5,*

（1.集美大学海洋食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；2.海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心（大连工业大学），辽宁 大连 116000；3.水产品深加工技术国家地方联合工程研究中心，福建 厦门 361021；4.福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建 厦门 361021；5.厦门市食品与生物工程与技术研究中心，福建 厦门 361021）

我国是水产品生产大国，水产品总产量连续多年位居世界第一，2020年全国水产品总量为6 545万 t[1]。水产品中含有丰富的蛋白质、ω-3多不饱和脂肪酸、维生素和矿物质等营养物质，是日常膳食的重要组成部分[2]。风味是评价水产品品质的一项重要指标，也是消费者选择食品的主要依据之一，对水产品的风味进行分析及改良控制具有重要的科学及产业价值。

风味成分萃取富集方式主要有顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）、同时蒸馏萃取[3]、吹扫捕集法和溶剂辅助风味蒸发等[4]，其中HS-SPME操作简单便捷、样品用量少、灵敏度高[3]，广泛应用于各类风味物质的萃取。风味成分鉴定分析方法主要有气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[5]、气相色谱-质谱-嗅闻法[6]、气相色谱-飞行时间质谱法[7]等，其中GC-MS仪器价格最便宜，应用范围最广[8]。风味评价主要采用感官评价法。对风味感官及成分差异进行统计分析的方法包括主成分分析[9]、方差分析[10]和偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）[8]等。PLSR将复杂数据简单化，其评价模型可用于风味品质的量化评价。

水产品风味主要由脂类水解、氧化、美拉德等反应形成。在肌肉和脂肪组织中，脂肪酶和磷脂酶水解脂肪，释放游离脂肪酸，进一步氧化产生挥发性化合物，形成产品风味[11]。此外，有学者发现酶和微生物均对咸鱼熟化阶段的风味形成具有重要作用[12]，热加工方式及热风干燥温度对水产品风味影响显著，（45f2）℃中温风干和（30f2）℃低温风干产品感官评价较好[13-14]。这些原因导致不同加工工艺制得的水产加工制品风味存在明显差异。目前，针对加工温度、腌制和风干工艺等对水产品及其加工制品风味物质影响的研究较多，关于水产品加工过程中热处理和内源酶引起风味成分变化规律研究尚不深入。

鲈鱼（Lateolabrax japonicus）是我国淡水名鱼之一，其肉质坚实白嫩，清香、无腥味，富含蛋白质、B族维生素、VA和多不饱和脂肪酸[15]，是重要的经济鱼类。有学者发现鲈鱼干样品在腌制风干不同阶段的挥发性成分差异显著[16]。基于此，本研究采用感官评价和GC-MS结合PLSR分析，研究鲈鱼干加工过程中内源酶和热处理引起的风味特征及成分变化，以期为优化鲈鱼干加工工艺提供理论基础，同时为理解内源酶和热处理对水产品风味的影响提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冻鲜鲈鱼中段肌肉 广东省中山市大成冷冻食品有限公司。

2,4,6 -三甲基吡啶、正构烷烃（C8～C20）（均为色谱级） 美国Sigma-Aldrich公司；无水乙醇（优级纯）、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸铵（均为分析纯）国药集团化学试剂有限公司；食用盐 福建省盐业集团有限公司；鱼组织蛋白酶B（Cath-B）酶联免疫吸附测定试剂盒 上海晶抗生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

GC-MS-QP2010 plus GC-MS仪 日本岛津公司；Rtx-5MS毛细管色谱柱（60 mh0.32 mm，0.25 μm）美国Restek公司；65 μm CAR/PDMS萃取头、HH-157330-U手动SPME进样器 美国Supelco公司；HH-1数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；XB-CPJ高速多功能粉碎机 永康市久品工贸有限公司；LRH-150恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；Epoch2.T酶标仪 美国伯腾仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鲈鱼干样品的制备

冻鲜鲈鱼在5 ℃冰箱中自然解冻24 h，清洗沥干后，切成4 cmh2 cm的鱼块，将3%食盐均匀涂抹鱼块，于5 ℃条件下采用干腌法腌制24 h。腌制结束后将鲈鱼样品表面盐分冲洗干净，用滤纸吸干鱼肉表面水分，按照如图1所示的工艺制备4种鲈鱼干样品。内源酶转化+轻度热处理（S1）组：将鱼肉置于40 ℃内置风机的恒温培养箱中风干4.5 h，风干后100 ℃蒸煮熟化10 min；内源酶转化+高强度热处理（S2）组：鱼肉经40 ℃风干4.5 h后200 ℃烘烤熟化10 min；轻度热处理（S3）组：鱼肉在腌制结束后先100 ℃蒸煮熟化10 min再40 ℃风干4.5 h；高强度热处理（S4）组：鱼肉腌制结束后先200 ℃烘烤熟化10 min再40 ℃风干4.5 h。制备好的鲈鱼干样品分别放入高速绞肉机中绞成鱼糜状，置于-18 ℃环境中冻藏备用。

图1 4种鲈鱼干样品制作工艺流程图Fig.1 Process flow chart for the preparation of four dried sea bass samples

1.3.2 鲈鱼干样品感官评价

采用定量描述感官评价方法，评价小组由10 名成员组成，其中男性5 名、女性5名。评价人员根据GB/T 16291.1ü2012《感官分析 选拔、培训与管理评价员一般导则》进行培训，分别对鲈鱼干样品5种感官属性进行评价，包括青草香、甜香、橘香、脂香和鱼腥味。风味强度采用5 分制进行打分（0 分没有香气，5 分香气最强），记录每位评价人员的评分，每个样品重复评价3次。

1.3.3 鲈鱼中组织蛋白酶B的提取及活力测定

取S1和S2组风干后、S3组蒸煮熟化和S4组烘烤熟化后鲈鱼干样品立即用液氮冷冻，磨成细腻粉状，各取样品（5.00f0.01）g，按照料液比1∶2加入pH 5.8 50 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS），在冰浴条件下高速匀浆5次（18 000～22 000 r/min、每次10 s、间隔2 s），然后12 000 r/min、4 ℃冷冻离心30 min，用纱布过滤收集上清液，用等体积的饱和(NH4)2SO4溶液盐析过夜后离心（10 000 r/min、30 min、4 ℃），所得沉淀用20 mmol/L pH 6.0 PBS溶解后装入透析袋充分透析12 h，透析完成后离心（10 000 r/min，30 min、4 ℃）取上清液，用滤纸过滤后再用0.45 μm滤膜过滤，即得到粗酶液[17]。通过鱼组织蛋白酶B（Cath-B）ELISA试剂盒进行显色反应，在450 nm波长下检测，建立标准曲线计算组织蛋白酶B活性。酶活力单位定义为在最适温度37 ℃、pH 6.0条件下，每分钟水解底物1 nmol 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的酶量，单位U/g。

1.3.4 鲈鱼干样品GC-MS分析

分别取S1、S2、S3和S4组鲈鱼干样品2 g于20 mL顶空瓶中，再加入2 mL 5 g/100 mL NaCl溶液和1 μL 5 mg/mL 2,4,6-三甲基吡啶标准溶液（内标物），混合均匀后密封瓶口，置于60 ℃水浴锅中平衡30 min，平衡结束后将经250 ℃老化后的SPME头插入顶空瓶中顶空吸附30 min。吸附完成后迅速插入GC进样口解吸附3 min，进行GC-MS分析。每个样品进行4次平行实验（样品重复），定量结果取4次实验平均值。

GC条件：Rtx-5MS色谱柱（60.0 mh0.32 mm，0.25 μm），载气高纯度氦气（99.999%），柱流量3.04 mL/min，不分流进样；程序升温：初始温度35 ℃，保持3.0 min，以8 ℃/min速率升到120 ℃，再以5 ℃/min速率升到250 ℃，保持5 min，总程序时间44.63 min。

MS条件：离子源温度230 ℃，电子电离源，电离能量70 eV，接口温度250 ℃，扫描方式Scan模式，扫描范围m/z35～450，溶剂延迟时间3 min。

对比NIST11、NIST11s、FFNSC1.3质谱数据库进行相似度检索，根据不同化合物的基峰、质荷比进行串联检索与人工解析，化合物鉴定标准为其质谱匹配度大于80%。计算样品中挥发性成分的保留指数（retention index，RI）与文献报道的RI进行比对以及特征离子碎片等进行定性分析。RI参照Van Den Dool等[18]的方法按式（1）计算：

式中：tn和t（n+1）分别为待测组分出峰前后碳原子数为n和n+1正构烷烃的保留时间/min。

采用内标法进行定量，根据2,4,6-三甲基吡啶质量浓度，按式（2）计算待测物含量：

1.4 数据统计分析

使用Microsoft Office Excel 2016软件处理实验数据，结果表示为 fs，制作柱状图；采用SPSS 17.0软件进行差异显著性分析；使用Unscrambler VersionX 10.4软件进行PLSR分析。

2 结果与分析

2.1 不同鲈鱼干样品的感官定量描述分析

风干腊鱼主要呈青香、果香和脂香等香气[19]。热加工后肉制品主要呈脂香和肉香[20]，蒸煮后的水产品鱼腥味增强，青草香等香气减弱[21]。如图2所示，4 组鲈鱼干样品均呈现不同程度的青草香、脂香、橘香、鱼腥味和甜香。S1组青草香和甜香强度明显大于S3组。S3和S4鲈鱼干样品的脂香强度均略大于S1和S2组。此外，鲈鱼干样品S3表现出较明显的橘香和令人不适的鱼腥味，这与同样经过蒸煮熟化处理的S1组样品形成较大反差。以上结果表明，4种不同加工工艺的鲈鱼干样品整体香气轮廓与相关文献报道一致，但内源酶及热处理对香气具有显著影响。其中S1和S2组鲈鱼干样品中内源酶参与化学反应可显著提高青草香和甜香，并减弱鱼腥味。轻度热处理提高了S3组鲈鱼干样品的鱼腥味和橘香；高强度热处理显著增强了S4组鲈鱼干样品的脂香，但降低了其甜香。

图2 4种鲈鱼干样品感官评价雷达图Fig.2 Radar chart of sensory evaluation scores of four dried sea bass samples

2.2 不同加工工艺鲈鱼干样品风味成分的分析

蔡国华[14]在低温风干工艺制备的河鲀鱼中检出醇、醛、酮、酯和烃类等挥发性成分；王珏等[13]在蒸煮鲐鱼样品中鉴定出醇、酮、醛和烷烃类等挥发性成分；荣建华等[22]对脆肉鲩生鲜、蒸熟鱼肉的挥发性成分进行检测，发现蒸制前后脆肉鲩鱼肉中主要挥发性物质为2-乙基己醇、1-辛烯-3-醇、己醛和壬醛等；徐永霞等[23]研究热处理对鲈鱼风味的影响发现，辛醛、壬醛、苯甲醛、2-庚酮、1-辛烯-3-醇、1-庚醇等为其主要挥发性化合物。图3A为4 组鲈鱼干样品挥发性成分的总离子流图。由表1和图3B可知，在4 组鲈鱼干样品中共鉴定出41种挥发性成分，正己醛（135.36～340.32 μg/L）、壬醛（51.36～147.58 μg/L）、正辛醛（21.09～37.42 μg/L）、丁子香酚（341.71～739.64 μg/L）、1-辛烯-3-醇（68.54～81.91 μg/L）、2,3-辛二酮（28.13～38.63 μg/L）、苯甲醛（15.30～22.56 μg/L）、石竹烯（6.33～41.51 μg/L）和2,6-二叔丁基对甲酚（102.13～223.43 μg/L）质量浓度均较高，为鲈鱼干样品主要挥发性成分。其中，正己醛和丁子香酚在4种鲈鱼干样品中含量均最高，这与康翠翠等[24]报道加热鲈鱼肉中含量最高的风味成分为己醛和壬醛等具有一定相似性。4种鲈鱼干样品中的挥发性成分含量差异显著，这主要是由于不同强度的热处理与内源酶的相互作用导致，该结果与谭汝成[25]对腌腊鱼制品工艺优化的研究结果一致。

图3 鲈鱼干样品中挥发性风味物质的总离子流图（A）和定量分析热图（B）Fig.3 Total ion current chromatogram (A) and heat map (B) of volatile substances from dried sea bass

与S3组相比，S1组鲈鱼干样品中正己醛、壬醛、苯甲醛、2-壬烯醛和反-2-辛烯醛等醛类物质含量更高。郭雅[26]研究发现壬醛、己醛和反-2-辛烯醛等是风干鳊鱼主要风味物质，风干过程中内源酶参与的生物化学反应促进了醛类等挥发性成分的生成。S1组醛类和酮类物质含量是S3组的2 倍以上，反映了鲈鱼加工过程中内源酶将不饱和脂肪酸转化生成小分子醛、酮类物质的重要性。S3组鲈鱼干样品中1-己醇、2-乙基己醇、1-辛烯-3-醇、异佛尔酮、癸烯醛等物质含量高于S1组，其醇类物质含量较高。其中2-乙基己醇和异佛尔酮仅于S3组中检出，是其主要挥发性成分。施文正等[10]研究发现不同温度条件下草鱼肉主要挥发性成分为1-己醇、2-乙基己醇、1-辛烯-3-醇等。表明对水产品进行高温热处理有利于脂肪降解和其他物质转化生成醇类物质。

S4组鲈鱼干样品中大多数挥发性成分含量高于S3组，且香叶基丙酮、十一醇、反-2-壬烯-1-醇、1-十一烯等物质是区分S4和S3组鲈鱼干样品的主要挥发性成分。高温可以降低脂质氧化或氢过氧化物分解形成过氧自由基所需活化能，有助于脂质氧化的发生。因此，高强度的热处理更有利于鲈鱼干样品中挥发性成分的形成。S1与S2组、S3与S4组之间主要为醇类物质含量存在较大差异，表明高强度的热处理对醇类等挥发性成分的生成影响显著。

S1与S2组鲈鱼干样品中大部分挥发性成分的含量均高于S3和S4组，S1和S2组中丁子香酚、石竹烯、蛇麻烯和2,6-二叔丁基对甲酚含量均高于S3和S4组。这是主要与鲈鱼干样品加工过程中的内源酶转化作用有关。Xu Weimin等[27]研究发现内源酶转化作用有助于提高肉制品中挥发性成分含量，内源酶参与的生物化学反应对肉制品风味影响显著。

表1 4种鲈鱼干样品中挥发性成分定性定量结果Table 1 Qualitative and quantitative results of volatile components in four dried sea bass samples

续表1

2.3 鲈鱼干样品挥发性成分与感官属性PLSR相关性分析

为进一步探究鲈鱼干样品挥发性风味化合物与5种感官属性（甜香、脂香、青草香、鱼腥味和橘香）之间的潜在相关性，以41种挥发性成分作为自变量（X），5种感官属性作为因变量（Y），进行PLSR分析。如图4所示，PLSR解释了73%的X变量方差和89%的Y变量方差，香气感官属性和大多数香气物质位于50%和100%的解释方差之间，可以很好地被PLSR模型解释；因子1与鱼腥味正相关，而与其他4种感官属性呈负相关；因子2与橘香和甜香正相关，而与脂香和青草香负相关。苯甲醛（8）和2,3-辛二酮（12）与橘香相关性较高；癸烯醛（31）与脂香相关性较好；庚醇（9）与青草香密切相关；正辛醛（14）和苯乙酮（23）与甜香相关性较好。可见，苯甲醛、庚醇、2-乙基己醇、正辛醛、癸烯醛和苯乙酮等风味物质对鲈鱼干样品的整体香气有重要贡献。Qian Min等[28]研究发现腌制和热加工肉制品中苯甲醛、正辛醛和庚醇等挥发性成分对其香气的形成影响显著。

图4 鲈鱼干样品中挥发性风味化合物与感官属性PLSR相关性分析载荷图Fig.4 PLSR loading plot for correlation analysis between volatile flavor compounds and sensory attributes

由表1可知，S1和S2组中呈甜香的苯甲醛和呈青草香的庚醇的含量均高于S3和S4组，具有脂香的癸烯醛在S4组中含量较高，呈橘香的正辛醛和芳香的2-乙基己醇在S3和S4组中含量较高，该结果与鲈鱼感官评价结果（图2）基本一致。鱼类中不饱和脂肪酸和蛋白质等物质在内源酶作用下生成大量醛、酮类物质，如苯甲醛、正辛醛、己醛和苯乙酮等[29]。组织蛋白酶B等系列内源蛋白酶促进蛋白质水解，氨基酸发生转氨基、脱氢、脱羧和还原反应，从而生成苯甲醛和苯乙酮等芳香族类物质[30-31]。已有研究表明癸烯醛、正辛醛和2-乙基己醇为热处理鱼类中的主要挥发性成分[24]。苯甲醛、庚醇和苯乙酮主要由内源酶作用产生[26,32]。脂质结构中酰基酯中任意碳氢位点都能与自由基结合，进而形成新的香气物质或随后再次降解为小分子物质，如2-乙基己醇、1-辛烯-3-醇、异佛尔酮和癸烯醛等，甘油三酯在热诱导作用下分解成游离脂肪酸，游离脂肪酸转化生成酮类物质，进而氧化生成醛、醇类物质如2-乙基己醇和正辛醛（图5）。

图5 苯丙氨酸在内源酶作用下生成苯乙酮和甘油三酯热氧化降解生成2-乙基己醇和正辛醛的途径Fig.5 Generation pathways of acetophenone from phenylalanine generates under the action of endogenous enzymes and thermal oxidative degradation of triglycerides to 2-ethylhexanol and n-octanaldehyde

如图6所示，S1和S2组风干后鲈鱼干样品组织蛋白酶B活力分别为44.95 U/g和44.33 U/g，S3组蒸煮熟化和S4组烘烤熟化后鲈鱼干样品中组织蛋白酶B活力分别为4.99 U/g和4.56 U/g；该结果验证了在风干阶段内源酶活力的存在，进一步佐证了内源酶在风干过程中对风味形成的重要影响。

图6 不同鲈鱼干样品中组织蛋白酶B活力Fig.6 Cathepsin B specific activity in dried sea bass samples

3 结 论

4种鲈鱼干样品具有不同的风味轮廓，其中经内源酶转化作用的S1和S2组主要呈青草香和甜香，轻度热处理的S3组鲈鱼干样品鱼腥味和橘香明显，高强度热处理的S4组鲈鱼干样品脂香较突出。在4种鲈鱼干样品中共检出41种挥发性化合物，其中醛类、酮类和醇类是鲈鱼干样品中挥发性成分的主要种类。正己醛、壬醛、苯甲醛、正辛醛、丁子香酚、1-辛烯-3-醇、2,3-辛二酮、石竹烯和2,6-二叔丁基对甲酚等挥发性化合物含量较高，是鲈鱼干样品的主要挥发性化合物。PLSR分析表明苯甲醛、正辛醛、苯乙酮、癸烯醛、庚醇和2-乙基己醇是导致4种鲈鱼干样品风味差异的主要成分。内源酶作用的S1和S2组鲈鱼干样品中正己醛、壬醛、苯甲醛、庚醇、反-2-辛烯醛、丁子香酚和苯乙酮等含量较高，其中苯乙酮和苯甲醛等芳香族物质是氨基酸在一系列内源酶作用下发生转氨基、脱氢、脱羧和还原反应生成；S3组通过轻度热处理促进了正辛醛、2-乙基己醇、1-辛烯-3-醇和异佛尔酮等挥发性成分的生成；高强度热处理的S4组鲈鱼干样品中癸烯醛、壬醛、苯乙烯和反-2-辛烯醛等挥发性成分含量较高，甘油三酯在热处理过程中产生大量的醛、醇类物质如2-乙基己醇和正辛醛等。进一步检测组织蛋白酶B活力可知，S1和S2组鲈鱼干样品中的风味物质主要由内源酶在风干过程中积极参与生物化学反应生成；而S3和S4组鲈鱼干样品通过不同强度的热处理促进脂肪分解氧化生成风味物质。本研究丰富了鲈鱼干加工过程中内源酶和热处理等引起的风味特征及成分变化研究，为水产品风味的机理研究提供了参考。