红锥花粉离体萌发适宜条件及贮藏方法

郝海坤，申文辉，曹艳云，黄志玲，谭长强

（广西壮族自治区林业科学研究院 国家林业和草原局中南速生材繁育重点实验室，广西南宁 530002）

红锥（Castanopsis hystrix）又名刺栲、红栲，为壳斗科（Fagaceae）锥属植物，是华南地区重要的乡土阔叶珍贵用材和高效多用途树种，具有重要的生态和经济价值，是华南地区主要造林树种之一。20 世纪70年代以来，我国林业科研工作者开展了红锥生物生态学、引种栽培、良种选育和生态评价等研究[1-5]，有力地推动了红锥人工林的大面积发展。

人工控制授粉或杂交授粉是培育新品种的重要途径，花粉采集、贮藏以及生活力检测是杂交育种过程中的重要环节。花粉生活力受自身遗传特性和外界因素的影响，不同物种花粉生活力不同，温度和湿度是影响花粉寿命的重要因素。花粉在贮藏期间生命活动仍在进行，将消耗有机酸、可溶性糖等营养物质，花粉中的蛋白质、酶和核酸等物质也会变性，导致花粉生活力下降直至丧失，干燥和低温是花粉贮藏的常用方法[6]。

染色法和离体萌发法是目前常用的两种快速有效的花粉活力检测方法。染色法快速、简便，但具有选择性。离体萌发法则对所有花粉都适宜，能测定花粉萌发率和花粉管长度、观察花粉萌发过程，是一种简单、迅速的花粉活力检测方法[7]，已在农业和林业育种研究中得到广泛应用[8-10]。壳斗科的栗属植物锥栗（Castanea henryi）、板栗（Castanea mollissima）已有花粉萌发特性研究报道[11-13]，但是关于红锥花粉活力检测和贮藏的研究尚未见报道。本研究通过测定萌发率和花粉管长度，探索红锥花粉离体萌发的合适培养基和温度，揭示红锥花粉萌发特性和耐贮藏性，为今后开展红锥人工授粉、新品种培育提供参考。

1 材料与方法

1．1 试验材料

红锥花粉采自广西壮族自治区林业科学研究院树木园62年生红锥林（108°21′E，22°56′N）。在南宁，红锥花期是3— 4月。2018年3月13日清晨采集未开放的红锥花枝，于室内进行水培。次日早晨8:00 ～10:00剪下开放的花穗置于硫酸纸上，抖动花穗，花粉自然掉落于硫酸纸上，过200目筛得到纯净花粉用于试验。

1．2 花粉离体萌发条件试验

采用正交试验法（L16（45）），共设计16 个处理（表1）。采用液滴悬浮离体培养法，将不同浓度蔗糖和硼酸配制的培养液滴于载玻片上，用滤纸片蘸少许花粉置于液滴中，将载玻片置于铺有湿润滤纸的培养皿中，盖上盖子保湿，放入不同温度的恒温培养箱中培养。参考大叶相思（Acacia auriculiformis）[14]、西南桦（Betula alnoides）[15]和柚木（Tectona grandis）[16]花粉萌发规律，每隔2、4、6、20 和24 h，在显微镜下观察统计红锥花粉萌发数量（以花粉管长度大于花粉粒直径为标准计数），计算花粉萌发率（%）；花粉萌发数量稳定后测定花粉管长度。每个载玻片上观察2个视野，每处理4个重复。

表1 红锥花粉离体萌发条件试验因素与水平Tab.1 Experimental factors and levels of in vitro germination of C.hystix pollen

1．3 红锥花粉贮藏条件试验

参考大叶相思花粉贮藏特性[17]，将新鲜红锥花粉分成8 份，用硫酸纸包好，其中4 份放入密实袋中，另外4份放入装有干燥硅胶的密实袋内，密封袋口，标记后分别置于常温、5 ℃、-20 ℃和-80 ℃条件下保存。5、15、30、60 和365 天时，从花粉离体萌发条件试验中选出的最佳配方培养花粉，计算花粉萌发率并测定花粉管长度。每个载玻片上观察2个视野，每处理4个重复。

1．4 数据处理

采用Excel 软件处理数据；采用SPSS 软件进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2．1 蔗糖、硼酸及温度对红锥花粉萌发的影响

方差分析表明，蔗糖、硼酸及温度对红锥花粉萌发率均有显著影响（P＜0．05），对花粉管长度的影响均不显著（表2）。蔗糖最佳浓度为100 g/L，其花粉萌发率显著高于150和200 g/L（P＜0．05），花粉管长度最长；硼酸最佳浓度为200 mg/L，其花粉萌发率显著高于其他处理（P＜0．05），花粉管长度最长；花粉萌发的最佳温度为25 ～30 ℃，其中25 ℃花粉萌发率最高，30 ℃花粉管长度最长。

表2 3个因素对红锥花粉离体萌发的影响Tab.2 Effects of three factors on pollen germination of C.hystrix

处理6 的效果最好，花粉萌发率为28．23%，花粉管长度为260．45 μm，均显著大于其他处理（P＜0．05）（表3）。红锥花粉萌发的最适条件为25 ℃条件下，采用100 g/L 蔗糖+200 mg/L 硼酸培养液。在此条件下培养1 h未见花粉管伸出，2 ～4 h花粉管开始萌发，6 ～16 h 为花粉萌发高峰时段，24 h 后萌发停止，平均花粉管长度为260．45 μm。

表3 不同处理对红锥花粉萌发率和花粉管长度的影响Tab.3 Effects of different treatments on pollen germination rate and pollen tube length of C.hystrix

2．2 贮藏条件对红锥花粉萌发率的影响

红锥花粉离体萌发最佳处理为100 g/L 蔗糖+200 mg/L 硼酸培养液、在25 ℃恒温箱中培养24 h。采用此条件培养贮藏的花粉，测定其萌发情况。除在室温贮藏30 天时，红锥花粉萌发率为0 外，随时间延长，其他处理的花粉萌发率均呈现下降-回升-下降的现象。

贮藏5 天时，4 ℃+ 干燥剂贮藏的花粉萌发率最高（27．72%），其次为-80 ℃+ 干燥剂贮藏（27．64%），比贮藏前分别降低1．81%和2．09%；常温贮藏最低（14．32%），显著低于其他处理（P＜0．05），比贮藏前降低49．27%；其他贮藏条件的萌发率为24．31%～25．54%（表4）。

表4 不同贮藏时间和贮藏条件的红锥花粉萌发情况Tab.4 Pollen germination of C.hystrix stored at different time and different conditions

续表4 Continued

贮藏15 天时，-20 ℃+干燥剂贮藏的花粉萌发率最高（22．21%），其次为-80 ℃+ 干燥剂贮藏（21．36%），比贮藏前分别降低21．32%和24．34%；常温贮藏最低（2．67%），显著低于其他处理（P＜0．05），比贮藏前降低81．07%；其他贮藏条件的萌发率为12．36%～18．88%。

贮藏30 天时，除常温的萌发率为0 外，其他处理萌发率均有所回升，且与贮藏前的萌发率相近。-20 ℃+ 干燥剂贮藏的花粉萌发率最高（31．21%），其次为-80 ℃+干燥剂贮藏（30．52%），显著高于其他处理（P＜0．05），比贮藏前分别高出10．56%和8．11%；-20 ℃贮藏较低（24．10%），比贮藏前降低14．63%；常温贮藏的花粉已无萌发力；其他贮藏条件的萌发率为26．81%～28．42%。

贮藏60 天时，-20 ℃贮藏的花粉萌发率最高（31．31%），其次为4 ℃+ 干燥剂贮藏（30．84%），比贮藏前分别高出10．91%和9．24%；常温+干燥剂贮藏较低（16．12%），比贮藏前降低42．90%；常温贮藏的花粉已无萌发力；其他贮藏条件的萌发率为23．90%～30．49%。

贮藏365 天时，-20 ℃+ 干燥剂贮藏的花粉萌发率最高（30．54%），比贮藏前高出8．18%；其次为-20 ℃贮藏（27．56%），比贮藏前降低2．37%；4 ℃贮藏的花粉萌发率较低（4．17%），比贮藏前降低85．23%；常温和常温+ 干燥剂贮藏的花粉已无萌发力；其他贮藏条件的萌发率为16．16% ～26．43%。

2．3 贮藏条件对红锥花粉管萌发长度的影响

授粉成功还要有足够长的花粉管，才能保证花粉管到达子房与胚珠结合。贮藏5 天时，-80 ℃+干燥剂贮藏的花粉管最长（177．58 μm），其次是-20 ℃+干燥剂贮藏（165．10 μm），均显著大于其他处理（P＜0．05），比贮藏前分别降低31．82%和36．61%；常温贮藏最短（79．17 μm），比贮藏前降低69．60%；其他处理的花粉管长度为80．81 ～136．21 μm。

贮藏15天时，4 ℃贮藏的花粉管最长（94．90 μm），其次为-20 ℃+干燥剂贮藏（92．30 μm），比贮藏前分别降低63．56%和64．56%；常温贮藏最短（48．86 μm），显著低于其他处理（P＜0．05），比贮藏前降低81．24%；其他处理花粉管长度为75．49 ～85．76 μm。

贮藏30天时，-80 ℃+干燥剂贮藏的花粉管最长（89．39 μm），其次为-20 ℃+ 干燥剂贮藏（88．30 μm），比贮藏前分别降低65．68%和66．10%；4 ℃贮藏的花粉管长度较短（55．46 μm），显著低于其他处理（P＜0．05），比贮藏前降低78．71%；其他处理的花粉管长度为76．99 ～85．08 μm，差异不显著。

贮藏60 天时，-80 ℃+干燥剂贮藏的花粉管最长（101．29 μm），其次为-20 ℃贮藏（86．29 μm），比贮藏前分别降低61．11%和66．87%；4 ℃贮藏的花粉管长度较短（50．04 μm），比贮藏前降低80．79%；其他处理的花粉管长度为32．20 ～85．11 μm。

贮藏365 天时，-20 ℃+ 干燥剂贮藏的花粉管最长（108．61 μm），其次为-80 ℃+ 干燥剂贮藏（95．65 μm），比贮藏前分别降低58．30%和63．28%；4 ℃的花粉管长度较短（32．81 μm），比贮藏前降低87．41%；其他处理的花粉管长度为52．82 ～83．40 μm。

3 讨论与结论

离体萌发测定法对所有贮藏花粉或新鲜花粉都适宜，其中以液体培养法最简便[18]。蔗糖作为花粉萌发的基本培养基，可为花粉萌发提供营养，还可以调节花粉细胞的渗透压；硼参与花粉管顶端细胞壁的形成，因此添加适量的蔗糖和硼能够促进花粉萌发和花粉管伸长。不同植物花粉的产量、萌发特性均受遗传特性和环境等因素的影响。锥栗花粉最适萌发条件为在30 ～35 ℃环境下，采用5% ～7．5%蔗糖+ 400 ～900 mg/kg 硼酸作培养基[13]；西南桦花粉最适萌发条件为在30 ℃环境下，采用15%蔗糖+200 mg/kg 硼酸作培养基[15]；柚木花粉最适萌发条件为在29～33 ℃条件下，采用200 g/L 蔗糖+200 mg/kg 硼酸作培养基[16]；大叶相思花粉最适萌发条件为在30 ℃条件下，采用200 g/L蔗糖+300 mg/kg硼酸作培养基[14]；台湾桤木（Alnus formosana）花粉最适萌发条件为在25 ℃条件下，采用10%蔗糖＋100 mg/L硼酸做培养基[19]。本试验结果显示，红锥花粉在25 ～30 ℃条件下，采用100 g/L蔗糖+200 mg/L硼酸的培养液能较好地萌发。

低温和干燥有利于花粉贮藏。本试验中，红锥花粉在-20 ℃+干燥剂或-80 ℃+干燥剂贮藏条件下，效果较好；贮藏365 天时，萌发率仍有30．54%和26．43%，与贮藏前相比变化不大，花粉管长度分别为108．61和95．65 μm，比贮藏前分别降低58．30%和63．28%。这与大叶相思和柚木[16-17]相似；锥栗和白花树（Styrax tonkinensis）花粉在非干燥、-80 ℃低温环境贮藏效果较好[20-21]。经贮藏的花粉，其授粉结实能力需进行田间授粉试验才能确定。

除在室温贮藏30 天时，红锥花粉萌发率为0外，随时间延长，其他处理的花粉萌发率均呈现下降-回升-下降的现象。这与大叶相思、白花树、梨、枣（Ziziphus jujuba）和酸枣（Ziziphus jujubavar．spinosa）花粉经低温干燥的萌发特性相似[17，22-24]。刘孟军等[24]认为这是短期被迫休眠现象，其原因之一可能是干燥使得与花粉萌发有关酶的活性暂时受到抑制；另一方面，可能与部分未成熟花粉在贮藏过程中进一步后熟有关。具体原因有待进一步研究。

花粉是种子植物自然条件下遗传信息交流的载体，包含了该物种的所有基因类型，是植物种质材料之一，花粉的长期贮藏是种质资源保存和利用中的一项重要课题。低温冷冻贮藏只适于花粉的中、短期保存，超低温（液氮，-196 ℃）保存被认为是花粉保存的新途径。有研究表明，白掌（Spathiphyllum floribundum）花粉-196 ℃下贮藏2年，活力没有损失[25]；山茶（Camellia japonica）花粉经液氮保存13 ～20个月后，平均萌发率为53．2%，田间授粉结实率与当年新鲜花粉差异很小[26]。李秉玲等[27]的研究也表明绝大部分芍药（Paeonia lactiflora）品种花粉超低温保存4年后相对保持率＞50%，超低温保存的花粉中，大部分品种花粉的萌发率显著高于新鲜花粉，人工授粉后仍具有受精结实能力。红锥花粉是否能用此方法达到长期贮藏的目的需进一步研究。