不同化学型樟树叶挥发油及纯露对微生物的抑菌活性

杨素华，黎贵卿，陆顺忠，苏骊华，党中广

（1.广西特色经济林培育与利用重点实验室，广西南宁 530002；2.广西壮族自治区林业科学研究院，广西南宁 530002）

食品加工通常采用各种包装技术和方法来保存食物，但微生物污染仍不可避免[1]。据估计，全世界每年约有10% ～20%的食品腐败源于微生物影响。添加食品防腐剂仍是目前防止食品腐烂变质的重要手段之一[2-4]。食品防腐剂包括天然防腐剂和化学防腐剂。天然防腐剂是从植物、动物或微生物代谢产物提取的抗菌活性物质，具有高效、安全等化学防腐剂无法比拟的优点，越来越受到人们的青睐。

芳香植物挥发油是通过水蒸气蒸馏、溶剂萃取和微波辅助等手段提取的具有一定芳香气味的次生代谢物质的总称，由几十到上百种化合物组成，主要成分有单萜、倍半萜及其衍生物等[5]。研究发现，芳香植物挥发油抑菌效果较明显，对多种菌株均有显著的抑制作用，被广泛应用于食品加工、医疗保健、化妆品和农药研发等方面[6-8]。纯露是芳香植物挥发油的副产品，含有少量的挥发油成分及活性物质，具有良好的抗菌、驱虫及保健作用[2]。

樟树（Cinnamomum camphora）作为芳香植物之一，可从其根、干、枝、叶和果中提取挥发油，简称精油。按樟树叶挥发油的主成分可将樟树分为芳樟型、油樟型、脑樟型、龙脑型、柠檬醛型和异樟型[9-10]等。研究表明，樟树叶挥发油中主要含有1，8-桉叶油素、芳樟醇、松油醇、樟脑、龙脑和柠檬醛等化学成分[11-12]，具有一定的杀菌、消毒效果，是食品、香精香料和医药等的重要原料[13]。寇一鸣[14]通过筛选特定的香樟内生真菌对香樟精油组分进行生化修饰转化，能显著提高精油的抗菌和抗氧化作用。王芳等[15]采用微量稀释法测定香樟精油抑菌活性，发现精油对真菌有较高的抑制活性。付敬敬[16]通过扫描电镜和激光共聚焦显微镜直接观察到香樟精油对大肠埃希菌（Escherichia coli）生物膜数量及形态有显著抑制作用。采用抑菌圈试验和试管二倍稀释法研究香樟精油抑菌活性及其抑菌机理，发现香樟精油对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中度敏感，其抑菌机制可能是破坏细菌细胞膜结构，引起内含物渗漏，导致菌体缺乏营养物质而死亡[17-18]。

芳樟醇有左、右旋两种光异构体，由于天然芳樟醇有旋光性的特点，特别是左旋体在医药上的“生物效价”要比合成芳樟醇优异，且芳樟醇还具有抗菌、抗病毒和镇静等作用[19]。张婷[20]在筛选抗肿瘤小分子化合物时，发现天然小分子化合物芳樟醇能抑制多种人淋巴细胞白血病细胞增殖，能杀伤处于静止期的白血病细胞。王新伟等[21]采用纸片扩散法以及双倍稀释法研究牛至油、香芹酚和柠檬醛等对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细菌的抑菌效果，发现柠檬醛对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。马英姿等[22]采用杯蝶法测定樟树叶精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等的抑菌活性，发现樟树精油具有较好的抑菌效果，精油中的成分冰片有很强的抗菌作用。樟树叶挥发油具有良好的抑菌杀菌效果，而樟树叶纯露作为樟树叶挥发油的副产物，一般都作为废液丢弃。

本研究通过试管法和纸片法测定柠檬醛型、芳樟醇型（左旋、右旋）、油樟型和龙脑型樟树叶挥发油和纯露对几种常见食品微生物的抗菌效果，以期为樟树叶挥发油和纯露作为食品添加剂、防腐保鲜剂及消毒杀菌剂等综合开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 仪器

气相色谱仪（Agilent 7890A）；气相色谱-质谱联用仪（Agilent 7890B-5977A）；电子天平（T-500，常熟双杰测试仪器厂）；恒温（30 ～38 ℃）细菌培养箱（HYQX-II，上海跃进医疗器械有限公司）；恒温（20 ～28 ℃）霉菌培养箱（MJ-300，上海跃进医疗器械有限公司）；冰箱（BCD-212，西门子有限公司）；高压灭菌锅（SX-500，TOMY 公司）；高温干燥烤箱（300 ℃）（BPG-9050AH，上海一恒科学仪器有限公司）；恒温（30 ～38 ℃）水浴锅（HH-6，常州国华仪器有限公司）；电热套（98-I-B，天津市泰斯特仪器有限公司）；显微镜（BH2-U，OLYMPUS 公司）；0．2 μm 薄膜筛过滤除菌器（MILLEX GP）；圆底烧瓶、试管、量筒和烧杯等玻璃仪器。

1．1．2 样品

样品采自广西壮族自治区林业科学研究院海拔85 ～255 m 的种质资源库（108°57′E，23°55′N）。2020年9月和2021年5月，采集同1 株樟树东、南、西、北和中5个方位的新鲜叶，每种化学型樟树采集3 株。新鲜叶经广西林科院陆顺忠教授鉴定为柠檬醛型、芳樟醇型（左旋、右旋）、油樟型和龙脑型樟树叶。每株采样约500 g，用塑料袋密封，并置于4 ℃冰箱低温保存，待测。

1．1．3 试剂及培养基

培养基均源自北京陆桥技术有限公司，为胰酪大豆蛋白胨液体培养基（批号201010）、胰酪大豆蛋白胨琼脂培养基（批号190815）、沙氏液体培养基（批号190326）和沙氏琼脂培养基（批号200927）。其余试剂包括氯化钠（国药集团化学试剂有限公司）和蒸馏水。

1．1．4 对照品

阳性对照品包括：复方新诺明（400 mg 磺胺甲恶唑、80 mg 甲氧苄胺嘧啶）和抗真菌：洗必泰（氯已定含量＞99%）；阴性对照品为生理盐水；固体溶剂对照品为二甲亚砜。

1．1．5 菌株

金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性细菌）[CMCC(B)26003]；枯草芽孢杆菌（革兰氏阳性细菌）（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]；大肠埃希菌（革兰氏阴性细菌）[CMCC(B)44102]；铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104]；白色念珠菌（真菌）（Candida albicans）[CMCC(B)98001]。以上标准菌株均由广东环凯科技有限公司提供，试验所用菌株由冻干质控菌种转种所生，是本种源的5代内后裔。

1．2 方法

1．2．1 挥发油和纯露的提取

将采集到的新鲜叶子剪至1 ～2 cm，称取200 g，叶子和去离子水按1∶2．5 比例放入1 000 mL 圆底烧瓶内，加沸石，接上挥发油测定器及球形冷凝管，按《中国药典》[23]挥发油测定法（甲法）进行水蒸气蒸馏3．5 h，得挥发油和纯露。所得精油用一次性针管抽吸水分，用无水硫酸钠脱去残余水分。挥发油和纯露置于5 ℃冰箱，避光密封保存。

1．2．2 挥发油成分分析

升 温 程序：色谱柱：HP-INNOWAX（30 m ×0．32 mm，0．5 μm）；HP-5（30 m×0．32 mm，0．25 μm）。初始温度为70 ℃，以1．5 ℃/min升至100 ℃；以3 ℃/min升至135 ℃，保持30 min；再以5 ℃/min 升至200 ℃；最后以10 ℃/min 升至250 ℃，保持10 min。进样量0．2 μL，进样口温度250 ℃，分流比100∶1，流速1mL/min。

质谱条件：电离方式E1，电离能量70 eV，离子源温度250 ℃，质量扫描范围30 ～450 amu。

1．2．3 培养基的制备

取胰酪大豆蛋白胨液体培养基30 g，胰酪大豆蛋白胨琼脂培养基40 g，沙氏液体培养基50 g，沙氏琼脂培养基70 g，分别用蒸馏水配成1 L 溶液，高压灭菌，密封存放，备用。

1．2．4 菌悬液的制备

取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿脓假单孢菌和枯草芽孢杆菌冻干质控菌种的新鲜培养物接种至胰酪大豆蛋白胨液体培养基，置于35 ℃恒温箱培养24 h，转入无菌生理盐水，稀释，倒入胰酪大豆蛋白胨琼脂培养基，置于35 ℃恒温箱培养24 h；取白色念珠菌冻干质控菌种的新鲜培养物接种至沙氏液体培养基，置于25 ℃恒温箱培养48 h，转入无菌生理盐水，稀释，倒入沙氏琼脂培养基，置于25 ℃恒温箱培养48 h。试验菌悬液细菌密度约为50 ～100 cfu/mL。

1．2．5 抑菌性试验

采用试管法进行抗金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌和枯草芽孢杆菌试验。每种挥发油、纯露、阳性试验药液（复方新诺明）和阴性试验药液处理各准备灭菌玻璃试管5 支，每管加入胰酪大豆蛋白胨液体培养基2 mL。取已配制和除菌处理过的挥发油、纯露、阳性试验药液（复方新诺明）及阴性试验药液各2 mL 加入第l 管，混匀后取2 mL 加入第2 管，各管按稀释度2、4、8、16 和32 倍稀释至第5管，第5管混匀后弃去2 mL；每管加入细菌密度约为50 ～100 cfu/mL 的试验菌悬液0．1 mL。另取2 支试管作对照（CK），分别加入2 mL 胰酪大豆蛋白胨液体培养基和0．1 mL 菌悬液作有菌无药对照管，2 mL待检药液和2 mL 胰酪大豆蛋白胨液体培养基作有药无菌对照管。置35 ℃恒温箱培养24 h。在对照管无异常（有菌无药对照管混浊有菌生长，有药无菌对照管澄明无菌生长）的前提下观察各试验管细菌生长状况。培养液有紊絮状混浊或豆腐渣样凝块者为有菌生长，培养液澄清透明、且摇匀后仍液澄清透明者为无菌生长或菌生长受抑制。无菌生长或菌生长受抑制的最低待检药物浓度为最低抑菌浓度（MIC）。取无菌生长或菌生长受抑制试管内的培养物0．1 mL注入平皿，加入不超过45 ℃的胰酪大豆蛋白胨琼脂培养基15 ～20 mL，冷却后倒置于35 ℃恒温箱，培养24 h，观察菌落生长情况。生长菌落不超过5 个的琼脂培养基里的药物浓度，为该待检药物的最低杀菌浓度（MBC）[24]。

抗白色念珠菌试验。每种挥发油、纯露、阳性试验药液（洗必泰）及阴性试验药液各准备灭菌玻璃试管5 支，每管加入沙氏液体培养基2 mL。取已配制和除菌处理过的挥发油和纯露、阳性试验药液（洗必泰）、阴性试验药液2 mL加入第l管，混匀后取2 mL加至入2管，各管按稀释度2、4、8、16和32倍稀释至第5 管，第5 管混匀后弃去2 mL；每管加入细菌密度约为50 ～100 cfu/mL 的试验菌悬液0．1 mL。另取2 支试管作对照，分别加入2 mL 沙氏液体培养基和0．1 mL 菌悬液作有菌无药对照管，2 mL 待检药液和2 mL 沙氏液体培养基作有药无菌对照管。置于25 ℃恒温箱培养48 h。同上记录MIC。取无菌生长或菌生长受抑制试管内的培养物0．1 mL 注入平皿，加入不超过45 ℃的沙氏琼脂培养基15 ～20 mL，冷却后置于25 ℃恒温箱，倒置培养48 h，观察菌落生长情况，记录MBC[24]。每处理重复5次。

纸片法：取厚滤纸，用直径6 mm 冲子打出圆形纸片若干，高压灭菌。每张纸片分别吸取挥发油、纯露、复方新诺明、洗必泰、生理盐水和二甲亚砜，浸湿备用。分别将药贴片贴于涂有金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌和枯草芽孢杆菌的胰酪大豆蛋白胨琼脂培养基平皿内培养24 h；分别将药贴片贴于涂有白色念珠菌的沙氏琼脂培养基平皿内培养48 h。测量贴片周围抑菌圈直径，每处理重复3次。

2 结果与分析

2．1 不同类型樟树叶出油率和纯露得率

芳樟醇型樟树叶出油率较高，分别为2．02%（左旋）和1．95%（右旋）；柠檬醛型樟树叶的出油率较低（0．67%）（表1）。柠檬醛型樟树叶挥发油的主成分为柠檬醛，含量为65．05%；芳樟醇型樟树叶挥发油的主成分为芳樟醇（左旋和右旋），含量分别为88．92%和91．03%；油樟型型樟树叶挥发油的主成分为1,8-桉叶油素，含量为55．69%；龙脑型樟树叶挥发油的主成分为龙脑，含量为85．73%。芳樟醇型（左旋）油樟型樟树叶纯露的得率较高（0．52%），龙脑型樟树叶纯露的得率较低（0．45%）。

表1 不同类型樟树叶出油率和纯露得率Tab.1 Yield of essential oils and hydrolats from different types of C.camphora leaves

2．2 不同类型樟树叶挥发油和纯露抑菌效果

各菌株在适宜温度、经合适时间培养后，菌落或菌苔生长良好。阳性药贴片周围有明显抑菌圈，阴性药贴片周围无抑菌圈（表2）。芳樟醇型（右旋）挥发油对金黄色葡萄球菌、铜绿脓假单胞菌和白色念珠菌、芳樟醇型（左旋）挥发油对大肠埃希菌、柠檬醛型挥发油对枯草芽孢杆菌和白色念珠菌、油樟型挥发油对白色念珠菌均极度敏感，抑菌圈直径≥20 mm，抗菌效果很好。芳樟醇型纯露（左旋）对枯草芽孢杆菌和白色念珠菌均有抑制作用，其他类型纯露只对白色念珠菌有抑制作用。芳樟醇型（右旋）挥发油的抑菌效果最好，其次是油樟型挥发油。

表2 挥发油和纯露的抑菌圈直径Tab.2 Inhibition zone diameters of essential oils and hydrolats

续表2 Continued

2．3 不同类型樟树叶挥发油和纯露MIC和MBC

在合适温度下，各菌株经合适时间培养，有菌无药对照管混浊有菌生长，有药无菌对照管澄明无菌生长，阳性药管澄清透明，阴性药管有紊絮状混浊或豆腐渣样凝块。阳性药对所有细菌和真菌的MIC和MBC 均为31．25 μL/mL；阴性药没有抑菌和杀菌作用。柠檬醛型、芳樟醇型、油樟型和龙脑型樟树叶挥发油在不同浓度和不同菌株试验管中，均有呈澄清透明表现，说明不同类型挥发油对所有试验菌均有抑菌作用。柠檬醛型挥发油对所有试验菌、芳樟醇型（左旋）挥发油对金黄色葡萄球菌和铜绿脓假单孢菌的MIC 均为250 μL/mL；芳樟醇型（左旋）挥发油对大肠埃希菌、龙脑型挥发油对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿脓假单孢菌的MIC均为125 μL/mL；芳樟醇型（左旋）挥发油对枯草芽孢杆菌和白色念珠菌、龙脑型挥发油对枯草芽孢杆菌和白色念珠菌、芳樟醇型（右旋）和油樟型挥发油对所有试验菌的MIC均为31．25 μL/mL（表3）。芳樟醇型（右旋）和油樟型挥发油的抑菌能力最好，其次是龙脑型。

表3 挥发油和纯露的MIC和MBCTab.3 MIC and MBC of essential oils and hydrolats

续表3 Continued

续表3 Continued

续表3 Continued

芳樟醇型（右旋）挥发油对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌、油樟型挥发油对白色念珠菌、龙脑型挥发油对白色念珠菌的MBC均为500 μL/mL。芳樟醇型（左旋）挥发油对枯草芽孢杆菌和白色念珠菌、油樟型挥发油对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿脓假单孢菌及龙脑型挥发油对枯草芽孢杆菌的MBC 均为250 μL/mL，油樟型挥发油对枯草芽孢杆菌的MBC为125 μL/mL。油樟型挥发油的杀菌能力最好，其次是芳樟醇型（左旋）挥发油。

除芳樟醇型（右旋）纯露对所有试验菌的MIC为500 μL/mL 外，其他纯露只对白色念珠菌有抑菌作用。所有纯露均未发现有杀菌作用。

3 讨论与结论

3．1 叶出油率和纯露的得率

挥发油和纯露的提取和成分分析结果表明，柠檬醛型樟树叶挥发油的主成分为柠檬醛，芳樟醇型樟树叶挥发油的主成分为芳樟醇，油樟型型樟树叶挥发油的主成分为1,8-桉叶油素，龙脑型樟树叶挥发油的主成分为龙脑。不同化学型挥发油中，芳樟醇型和油樟型樟树叶中含有较高的挥发油（左旋芳樟2．02%、右旋芳樟1．95%，油樟1．65%），与胡文杰[25]研究中芳樟、脑樟、油樟、异樟和龙脑樟叶精油含量分 别 为1．34% ～2．16%、1．59% ～2．25%、1．61% ～2．24%、0．02%～0．06%和1．53%～1．93%相似。柠檬醛型樟树叶中的挥发油含量最低（0．67%），与杨素华等[10]研究中柠檬醛型樟树叶挥发油含量一致。油樟型芳樟醇型（左旋）樟树叶纯露的得率较高（0．52%），龙脑型樟树叶纯露的得率较低（0．45%）。

3．2 挥发油和纯露的抑菌活性

芳樟醇型（右旋）和油樟型挥发油抑菌效果较好；油樟型挥发油的杀菌效果最好；芳樟醇型（右旋）纯露的抑菌效果较明显；所有浓度的纯露在本试验中均未发现有杀菌效果。本研究的芳樟醇型（右旋、左旋）挥发油和芳樟醇型（右旋）纯露可应用于食品、香水、护肤品和医药中；油樟型挥发油可应用于天然消毒杀菌产品中。陈可欣等[26]发现香樟精油可有效抑制灰绿曲霉（Aspergillus glaucus），可作为天然抑菌剂应用于粮食储藏；王进等[27]研究发现香樟叶精油对供试真菌的抑制活性较好，可作为果蔬防腐剂；秦海燕等[28]发现香樟精油对肺炎小白鼠具有保护作用，可应用于医药方面的研究。

柠檬醛型和龙脑型挥发油对金黄色葡萄球菌，芳樟醇型（左旋）挥发油对金黄色葡萄球菌、铜绿脓假单孢菌和枯草芽孢杆菌在试管法中有抑菌作用，在纸片法中无抑菌活性，这可能是因为两个类型挥发油的抗菌成份为脂溶性物质，需综合考虑应用的领域，才能发挥其保鲜效果。柠檬醛型挥发油可应用于调配特定香型食品添加剂，龙脑型挥发油可应用于消炎药膏中。

芳樟醇型（右旋）纯露的抑菌效果较明显。正常情况下，纯露中有抑菌作用的挥发油成分，纯露应具有一定的杀菌作用。本研究中，纯露的杀菌作用基本没有，可能是纯露浓度偏低，所含的抗菌有效成分少，抑菌效果不明显。今后，可进一步研究精油和纯露的配比协同抑菌作用，最大程度减少纯露资源浪费。