载脂蛋白B100基因、低密度脂蛋白受体基因和枯草溶菌素转化酶9基因多态性与急性缺血性脑卒中伴脂代谢异常人群的相关性研究

魏建刚，张倩，孙薇，杨建波，汪毅明，林晓静，李慧萍，徐金凤，王蓉，韩佳容，张小宁

急性缺血性脑卒中是神经科常见的急性脑血管疾病，具有较高的致死率、致残率，是一种严重危害我国中老年人群的高发疾病。血脂代谢异常是诱发和促使血管动脉粥样硬化发生、发展的主要危险因素。家族性高胆固醇血症(FH)队列研究[1]发现，其中载脂蛋白B100(ApoB100)基因、低密度脂蛋白受体(LDLR)基因和枯草溶菌素转化酶9(PCSK9)基因SNP位点异常突变导致脂代谢异常，其参与动脉粥样硬化，最终导致脑梗死的发生。在非FH人群中，与脂代谢密切相关的基因不同单核苷酸多态性(SNP)位点突变信息，是否在脂代谢异常中起到一定的作用，仍然未得到证实。本次研究对象选取非FH人群，试图发现在急性缺血性脑卒中合并脂代谢的人群中，ApoB100、LDLR、PCSK9基因不同SNP位点基因型和等位基因的表达与其之间的相关性，现将研究结果展示如下。

1 对象与方法

1.1 对象 (1)病例组：选择2018年7月至2020年4月在我院神经内科住院的急性缺血性脑卒中合并脂代谢异常的患者，共60例，均符合急性脑梗死诊断标准，并经头颅MRI/CT证实，病因分型依据TOAST分型[2]，均为大动脉粥样硬化型。诊断标准参考2018年中国急性缺血性脑卒中诊治指南[3]。脂代谢异常按照《中国成人血脂异常防治指南(2016年修订版)》[4]。同时排除FH，成人FH诊断标准：推荐应用Shi等[5]根据中国情况改良的荷兰(DLCNC)评分标准。同时排除自身免疫性疾病、血液系统疾病、肿瘤性疾病、严重的肝肾功能不全、近期发生的感染、输血等。(2)对照组：选择同期我院体检中心健康体检者，共60人，均排除既往脑卒中病史、心脑血管病史、自身免疫性疾病史、血液系统疾病、肿瘤性疾病、肝肾功能不全、6个月内外伤手术史、3个月内有感染性疾病史。两组年龄、性别的差异无统计学意义(表1)。

1.2 方法

1.2.1 基因多态性检测 所有患者于入院次日静脉采血5 ml。采用溶液法DNA提取试剂盒(北京君诺得-2504B)提取DNA。用PCR扩增法检测ApoB100、LDLR、PCSK-9基因6个SNP位点信息，通过Pubmed、genebank、HapMap对比查询，结合文献寻找与脑卒中和脂代谢异常的高频率SNP位点，选择ApoB100基因SNP rs693，LDLR基因SNP rs1433099、rs5925，PCSK-9基因SNP rs2479408、rs17111503、rs529787。rs5925、rs1433099位点扩增体系中PCR Mix使用的是2×EasyTaq PCR SuperMix (+dye)(北京全式金-AS111)；其他位点使用的是2×SanTaq PCR Mix预混液(上海生工-B532061)。PCR扩增体系，DNA 1 μl，Forward Primer (10 μmol/L) 1 μl，Reverse Primer (10 μmol/L) 1 μl，PCR Mix 25 μl,ddH2O21 μl。PCR扩增程序，第一步预变性，温度94 ℃，时间3 min，循环1次；第二步变性，温度94 ℃，时间30 s；第三步退火温度见引物序列(表2)，30 s，循环35次；第四步延伸，温度72 ℃，24 s，第五步大延伸，温度72 ℃，时间5 min，循环1次。SNP位点的PCR鉴定电泳图见图1、图2。SNP位点的测序峰值图见图3、图4。

表1 病例组和对照组基线资料比较[ x±s,例(%),n=60]项目病例组对照组性别(男)38(63.3)35(58.3)年龄(岁)63.56±12.3262.28±11.72体重指数(BMI,kg/m2)24.89±3.4124.73±2.98高血压47(78.3)0糖尿病19(31.7)0冠心病23(38.3)0吸烟27(45.0)△7(11.7)总三酰甘油(TG,mmol/l)1.802±1.1311.521±0.785总胆固醇(TC,mmol/l)4.653±0.904△4.207±0.733低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C,mmol/l)3.567±0.551△2.372±0.526高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C,mmol/l)1.192±0.2761.323±0.206 注:与对照组比较△P<0.05

表2 不同基因SNP位点引物序列引物名称序列片段大小(bp)退火温度(℃)延伸时间(s)rs5925-F2GATTTGTCATCTTCCTTGCTGCC28455.124rs5925-R2GGCAGGAACGAGATCATCAGCTrs693-F2AGGCTCTGGAACTACCACAAAAA30555.124rs693-R2CCACCAATCAGAAATGTAGGTGACrs1433099-F2AATGGAAGTGGGTAGGGGTCGG29255.124rs1433099-R2ATGACCCACCCAGTGTCTTTCGAGrs2479408-F1CAAAGGGGAGCAGCAGGGAA3346124rs2479408-R1CCTGCTCTGAATCTAGGTGCTGGArs529787-F2GGTGGCAGCAGCAGAAGTGA2496124rs529787-R2GCCTGGACTGGGGTCTCTGTrs17111503-F1GTCTATGAGGGGAAGGCAATGG29056.724rs17111503-R1CCACAAGTGCTTTCTGGGTCAA

图1 SNP位点rs1433099 PCR鉴定电泳图。图中所有样本的PCR产物条带大小均符合，显示亮带，可以进行测序反应

图2 SNP位点rs17111503的PCR鉴定电泳图。图中所有样本的PCR产物条带大小均符合，显示亮带，可以进行测序反应

图3 SNP位点rs1433099的AA型测序峰值。图中测序峰型单一整齐，测序结果真实准确，样本45号该位点为单峰纯合子，基因型为AA

图4 SNP位点rs17111503的AG型测序峰值。图中测序峰型单一整齐，测序结果真实准确，其中样本25号在该位点为双峰杂合子，基因型为AG

1.2.2 基因RNA表达水平检测 采用荧光定量分析患者白细胞中各基因RNA表达情况。

1.2.2.1 RNA提取 用1 ml TRLZOL将细胞消化于离心管中，室温放置15 min以上；加入200 μl的氯仿，颠倒混匀后室温放置5 min；4 ℃，12 000 r/min离心15 min，吸取上清至另一个新的离心管中；加入等体积的异丙醇混匀，-20 ℃放置60 min；4 ℃，12 000 r/min离心15 min，小心倒掉上清液；加入75%的乙醇，使沉淀漂浮起来洗涤；4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，小心倒掉上清液。重复乙醇漂洗1次。空管离心，吸尽液体。用RNase free的水溶解沉淀，核酸蛋白定量仪检测RNA浓度，琼脂糖电泳检测RNA完整性，RNA反转录用于后续实验。

1.2.2.2 第一链cDNA反应 反应体系配制，Total RNA定量于800 ng Random Primer (0.1 μg/μl) 1 μl、2×TS Reaction Mix 10 μl,、TransScript@RT/RI Enzyme Mix 1 μl、gDNA Remover 1 μl、RNase-free Water Up to 20 μl，轻轻混匀，25 ℃反应10 min，85 ℃反应5 s取出，结束反转录实验。将反转录得到的cDNA置于-80 ℃保存，后续荧光定量检测的样本cDNA使用RNase-free Water按照1∶1的比例稀释进行反应。然后进行荧光定量实验，荧光定量PCR体系：Eva Green 2×qPCR MasterMix 10 μl、Forward Primer 0.6 μl、Reverse Primer 0.6 μl、cDNA 1 μl、RNase-free Water Up to 20 μl。荧光定量引物信息见表3，然后进行荧光定量PCR程序，第一步：预变性，95 ℃，10 min，循环1次；第二步：变性，95 ℃，15 s，循环0次；第三步：退火/延伸，60 ℃，60 s。

表3 荧光定量引物信息引物名称序列(5′-3′)片段大小LDLR-FCCTGACGAATTCCAGTGCTCT149bpLDLR-RCCGCTGTGACACTTGAACTTGApoB-FCCATCACTGCCAAAGGAGAGT154bpApoB-RATTTCACTCCCATGCTCCGTTPCSK9-FCCTCACCAAGATCCTGCATGT105bpPCSK9-RTAGTCGACATGGGGCAACTTChsaGAPDH_FTGTTGCCATCAATGACCCCTT202bphsaGAPDH_RCTCCACGACGTACTCAGCG

2 结 果

2.1 两组人群基线资料的比较 见表1。病例组患者血清TC、LDL-C水平均明显高于对照组(均P<0.05)。

2.2 Hardy-Weinberg平衡检验 见表4。Hardy-Weinberg平衡检验显示，本试验所选样本与整体样本无差异(P>0.05)，可代表整体样本。

表4 不同基因SNP位点基因型分布Hardy-Weinberg平衡检验(n=60)SNP位点等位基因(1/2)组别基因型频数observed(expected)1/11/22/2Hardy-WeinbergP值rs5925T/C病例组36(33.750)18(22.500)6(3.750)0.1213对照组41(39.200)15(18.600)4(2.200)0.1345rs1433099G/A病例组22(21.600)∗28(28.800)∗10(9.600)∗0.8296对照组38(37.600)19(19.790)3(2.600)0.7567rs693C/T病例组56(56.070)4(3.860)0(0.070)0.7894对照组54(54.150)6(5.700)0(0.150)0.6835rs2479408C/G病例组58(58.020)2(1.970)0(0.017)0.8955对照组57(57.040)3(2.925)0(0.038)0.8426rs529787C/G病例组54(54.150)6(5.700)0(0.150)0.6835对照组57(57.040)3(2.925)0(0.038)0.8426rs17111503G/A病例组26(22.820)∗22(28.370)∗12(8.820)∗0.0821对照组40(37.600)15(19.790)5(2.600)0.0607 注:与对照组比较∗P<0.05;1代表常见等位基因;2代表少见等位基因

2.3 不同基因SNP位点不同人群的等位基因的分布 见表4。SNP rs5925位点等位基因型分布上，病例组TT型出现比例低于对照组，而CC、CT型高于对照组，差异无统计学意义。SNP rs1433099位点等位基因型分布上，病例组GG型出现比例低于对照组，而GA、AA型高于对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)。SNP rs693位点等位基因型分布上，病例组CC型出现比例高于对照组，而CT型低于对照组，TT型出现率为0，差异无统计学意义。SNP rs2479408位点等位基因型分布上，两组人群等位基因基因型都以CC型为主，GG型在两组出现率为0。SNP rs529787位点等位基因型分布上，两组人群等位基因基因型都以CC型为主，GG型出现率为0。SNP rs17111503位点等位基因型分布上，病例组GG型出现比例低于对照组，而GA、AA型高于对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)。

表5 不同基因SNP位点等位基因在病例组与对照组中的分布及优势比估计(n=60)SNP位点等位基因病例组对照组χ2值P值OR值95%CIrs5925T90(0.750)97(0.808)0.6850.4081.5000.577～3.931C30(0.250)23(0.192)rs1433099A43(0.358)29(0.242)5.7140.0172.6671.178～6.034G77(0.642)91(0.758)rs693C116(0.967)114(0.950)0.2880.5921.6420.268～10.20T4(0.033)6(0.050)rs2479408C118(0.983)117(0.975)0.3420.5592.0360.178～23.09G2(0.017)3(0.025)rs529787C114(0.950)117(0.975)0.3780.5392.1070.182～23.89G6(0.050)3(0.025)rs17111503A46(0.383)25(0.208)4.8810.0272.4861.096～5.641G74(0.617)95(0.792)

2.4 不同基因SNP位点不同人群的等位基因的分布的优势比 见表5。SNP rs1433099位点等位基因型分布，等位基因A是AIS患病的危险因素(OR=2.677，P<0.05)。SNP rs17111503位点等位基因型分布，等位基因A是AIS患病的危险因素(OR=2.486，P<0.05)。

2.5 两组患者白细胞中各基因RNA表达量的比较 见表6。病例组ApoB100、PCSK9基因RNA表达量均明显高于对照组(均P<0.05)。

表6 两组白细胞中各基因RNA表达量的比较( x±s,n=60)组别LDLRApoB100PCSK9病例组1.877±0.9582.030±1.2773.126±1.207对照组1.344±1.1991.257±0.9541.255±0.895t值-1.900-2.657-6.819P值0.0620.0100.000

2.6 病例组SNP rs1433099和SNP rs17111503不同基因型间血脂代谢水平的比较 见表7。病例组SNP rs1433099的基因型GA+AA型LDL-C水平明显高于GG型(P<0.05)。SNP rs17111503的基因型GA+AA型LDL-C水平明显高于GG型(P<0.05)。

表7 病例组SNPrs1433099和SNPrs17111503不同基因型间血脂代谢水平的比较( x±s)基因型例数TCTGHDL-CLDL-Crs1433099 GG384.592±1.0951.981±1.1591.203±0.3023.443±0.510 GA+AA224.714±0.5521.621±1.0161.181±0.3163.691±0.314∗rs17111503 GG404.504±0.9461.587±1.0921.216±0.3223.341±0.491 GA+AA204.802±0.7542.017±1.1271.168±0.3073.794±0.279∗ 注:与GG型比较∗P<0.05

3 讨 论

脑卒中是世界上第二大死亡原因(仅次于缺血性心脏病)，约占所有死亡人数的9%。急性缺血性卒中是最常见的类型，约占所有脑卒中的80%～90%[6]。近年来我国的流行病学资料[7]表明，脑血管疾病在人口死因顺序中位居首位。与其他发达国家相比，我国脑卒中的发病率和死亡率明显高于心血管疾病。临床诊断FH的患者进行ApoB100、LDLR和PCSK9基因检测，现已发现超过1 700个变异，但只有少数在功能上被证实可引起FH，提示FH诊断困难。有研究[8]显示，FH患者中已被发现的变异数为LDLR-1915，ApoB-107，PCSK9-139。本研究的对象排除了FH患者，研究在急性缺血性脑卒中合并脂代谢异常的人群中，是否也存在类似FH患者ApoB100、LDLR、PCSK9基因SNP多态性表现。

国内外大量基础和临床研究已经证实，ApoB作为载脂蛋白家族中的重要成员是引起ASCVD的重要病理生理基础。2019年欧洲心脏病学会(ESC)和欧洲动脉粥样硬化学会(EAS)血脂异常管理指南[9]已经推荐ApoB作为风险评估方式，特别是在高TG水平的受试者中，可能有助于分类高TG血症表型及作为其相关心血管风险的诊断指标。ApoB是异源代谢物中作为血糖体的关键结构蛋白，VLDL和LDL作为肝LDL受体的主要配体，位于2p23-24的ApoB基因(ENSG00000084674)的显著宽位点包含几个多态位点，这些位点被描述为心血管事件风险的修改剂[10-11]。

LDLR是一种细胞表面的糖蛋白，负责结合和摄取血浆低密度脂蛋白颗粒，并发挥维持细胞胆固醇稳态的关键作用[12]。Lee等[13]研究分析了rs688和rs5925多态性的LDLR，在中国台湾地区人口提供初步证据表明遗传多态性LDLR与脑梗死相关。LDLR介导的LDL内吞途径被认为是机体清除血浆LDL最为重要和高效的方式[14]。LDLR与血液中的LDL在膜上结合成LDL/LDLR复合物，后被合并到包合网格蛋白的囊泡中，囊泡在核内体内解离，LDLR自由地返回到细胞表面(循环)，而LDL则被运送到溶酶体，在溶酶体中被降解。LDLR被认为在胆固醇体内平衡方面发挥重要作用。LDLR基因突变可能减少LDLR的表达水平，导致LDL-C水平的升高，引起受体功能障碍和FH，最终诱发脑梗死的发展[15]。

PCSK9作为一种进一步降低LDL-C水平新的治疗靶点，它是一种强烈参与LDL-C代谢的蛋白[16-18]。PCSK9已被证实在调节血浆LDL-C水平中起关键作用，PCSK9似乎通过将受体靶向到溶酶体降解来干扰LDLR循环，导致LDL-C从循环中清除减少[19-21]。PCSK9基因的某些突变可以改变蛋白质的氨基酸结构，从而改变其酶活性、功能和对LDLR的亲和力。根据PCSK9基因突变对血浆胆固醇水平的影响，将其分为功能获得型突变和功能缺失型突变。功能获得型突变的PCSK9与高胆固醇血症密切相关，会引起动脉粥样硬化[22]。功能缺失型突变的PCSK9能减少LDLR的内吞，使LDLR不容易被清除，从而降低血液胆固醇[23-24]。

本次研究对象为急性缺血性脑卒中合并脂代谢异常的人群，临床依据TOAST分型，病因分型为大动脉粥样硬化型。通过研究分析ApoB100、LDLR、PCSK-9基因不同SNP位点信息在两组人群的表达情况，发现rs5925位点等位基因型分布上，TT型在两组均占优势，T等位基因在病例组占比75%，对照组占比80.8%，其中CT、TT型病例组高于对照组，差异无统计学意义。rs1433099位点等位基因型分布上，病例组以GG型占优势，G等位基因在病例组和对照组占比分别为64.2%、75.8%，A等位基因在病例组和对照组占比分别为35.8%、24.2%，而GA、AA型高于对照组，差异有统计学意义。rs693位点等位基因型分布上，病例组以CC型为主，C等位基因在病例组占比96.7%，而CT型低于对照组，两组均未见TT型变异，差异无统计学意义。Alves等[25]在巴西老年人群中的研究发现，SNP rs693分型结果显示37.6%的C等位基因为纯合子，49.2%为杂合子，13.2%为T纯合子。当单独考虑时，T等位基因的纯合子的平均血清LDL和TC水平比C等位基因的杂合子和纯合子的各自水平高约10 mg/dl。rs2479408位点等位基因型分布上，两组人群等位基因的基因型都以CC型占优势，C等位基因占比98.3%，GG型在两组变异率为0%。rs529787位点等位基因型分布上，两组人群等位基因基因型都以CC型占优势，C等位基因占比95.0%，GG型在两组变异率为0%。rs17111503位点等位基因型分布上，病例组GG型占优势，G等位基因在病例组和对照组占比分别为61.7%、79.2%，A等位基因在病例组和对照组占比分别为38.3%、20.8%，而GA、AA型高于对照组，差异有统计学意义。通过对不同SNP位点人群的等位基因的分布的优势比发现，rs1433099位点等位基因基因型，GA+AA与GG比较，等位基因A为AIS发病的危险因素(OR=2.677,P=0.017)。

Yan等[26]研究发现LDLR基因多态性可能与脑梗死的发病机制密切相关，其中rs11669576 A/T、rs1433099 C/T、rs5925 C/T基因多态性可能与脑梗死的发病机制密切相关。rs17111503位点等位基因基因型分布，GA+AA与GG比较，等位基因A为AIS发病的危险因素(OR=2.486，P=0.027)。Han等[27]发现PCSK9基因SNP rs17111503 AA基因型与腔隙性脑梗死的发病率之间存在显著的强相关性，提示AA基因型可能在腔隙性脑梗死中起重要的致病作用，该位点的A等位基因通过影响中国汉族人群的低密度脂蛋白胆固醇水平和其他血清成分，增加缺血性脑卒中的风险，从而导致腔隙性梗死的发生，与本次研究结果一致。同时还对rs1433099和rs17111503与血脂代谢水平进行了分析，发现rs1433099、rs17111503的基因型GA+AA型与GG型比较，携带A等位基因的病例组和对照组比较，具有较高的血清LDL-C水平，差异具有统计学差异(P<0.05)。Polisecki等[28]研究发现PCSK9基因SNP R46L(rs11591147)携带GT基因型与GG型相比，男性和女性的血清LDL-C水平显著降低(P<0.001)，男性降低7.5%或10.1 mg/dl，女性降低11.9%或17.3 mg/dl，同时在TC和ApoB水平的差异也具有统计学意义(均P<0.001)。

通过研究与脂代谢异常密切相关的ApoB100、LDLR、PCSK9三个基因6个SNP位点信息，发现SNP等位基因位点发生突变的情况下，血脂代谢异常与其携带的等位基因和基因类型存在相关性，本次研究发现rs1433099(LDLR)和rs17111503(PCSK9)携带的等位基因A与急性缺血性脑卒中发病的危险因素，同时发现其与血清LDL-C的水平存在相关性。本次研究尚存在不足之处，纳入样本量较少，结果仍需大样本的人群验证。SNP位点的多态性和ApoB100、LDLR、PCSK9血清水平之间的相关性值，血清PCSK9的高低和PCSK9抑制剂使用的个体差异，在基因分子水平是否存在药物代谢的差异性等，均有待进一步研究。