五倍子单宁酸中没食子酸的去除及其含量测定

李志遥，李珂，张妮，任海，宋俊蓉，王绍江，陈超，潘卫东*，3

(1.贵州大学 药学院， 贵州 贵阳 550002；2.贵州医科大学 省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室， 贵州 贵阳 550014；3.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室 贵州省天然药物工程研究中心， 贵州 贵阳 550014；4.贵阳单宁科技有限公司， 贵州 贵阳 550001)

0 引言

五倍子(Gallachinensis)为倍蚜科昆虫角倍蚜或蛋倍蚜在其寄主漆树科植物盐肤木、青麸杨或红麸杨等树上形成的干燥虫瘿，其药用历史悠久，收载于2020版《中国药典》[1-3]。研究表明，单宁酸具有多种生物活性，如抗菌、抗癌、抗氧化、治腹泻、止血等[4-7]。五倍子中的主要成分为单宁酸，质量分数为50%～70%[8]。单宁酸在市场上的应用十分广泛，目前国家林业局根据其用途不同将单宁酸分为3个不同等级，主要包括：食品级单宁酸，在食品工业中用作食品添加剂或酒类、饮料的澄清剂和稳定剂[9-10]；工业级单宁酸，主要用于皮革、墨水、木材粘连剂等化工行业[11-12]；药用级单宁酸，作为止血剂、抗癌药、重金属解毒剂等药品的组成广泛运用于医药行业。其中食品级单宁酸和药用级单宁酸的使用标准最高，而没食子酸杂质的含量是评价其等级的重要考察指标之一。没食子酸不易从单宁酸中除去，严重影响了单宁酸的品质，导致其使用范围受限。分析没食子酸的来源主要有2个方面：一是植物代谢；二是提取与纯化过程中条件控制不当而引发单宁酸水解生成没食子酸。由于没食子酸的物化性质与单宁酸相似，因此在纯化过程中不易被去除。虽然单宁酸中没食子酸的纯化工艺有所报道，如活性碳吸附、大孔树脂吸附、膜分离技术、离子交换技术、分子蒸留技术等[13-14]；但上述纯化工艺复杂，成本高，污染严重，不适合工业放大生产，因此新的纯化工艺亟待研究开发。

对比分析没食子酸与单宁酸的结构特点，其中从没食子酸的化学结构(3,4,5-三羟基苯甲酸)可以判断其同时具有苯酚和羧酸的化学性质。连苯三酚、苯甲酸的酸度系数(pKa)分别为15.2、4.2，由此可知苯甲酸的酸性比连苯三酚的酸性强，从而推测没食子酸水溶液遇到碳酸氢钠等碱性物质时，优先与羧基反应生成3,4,5-三羟基苯甲酸钠盐，而单宁酸只有连苯三酚基团而无羧基，不会优先与碳酸氢钠等碱性物质反应。在荆才等[15]的实验中，考察了以pH为6.8、7.5的磷酸钠盐溶液和质量分数为1%、3%碳酸钠溶液为反萃剂考察对单宁酸中没食子酸残留量的影响，单因素试验发现，使用pH为6.8的磷酸钠溶液作为反萃剂时，单宁酸中没食子酸残留量最低，质量分数为1.02%，同时认为反萃剂对单宁酸中没食子酸残留含量有极显著影响。在此实验基础上，本实验设想在粗品单宁酸(除了没食子酸含量高于食品级指标，其他指标均达到食品级)水溶液中加入其他碱性物质，使没食子酸生成盐，溶于水中，以乙酸乙酯为萃取剂，利用单宁酸在乙酸乙酯溶液和反萃(取)剂分配系数不同，通过萃取技术使极大部分单宁酸分配进入乙酸乙酯，从而达到提纯目的；采用单因素实验方法，考察碱性物质对单宁酸纯化工艺的影响，建立单宁酸生产中的精制工艺，减少生产成本，提高相关产业的经济效益。

1 实验

1.1 试剂和仪器

安捷伦1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；天平(赛多利斯，SQP型)；分析柱为C8色谱柱(依利特，4.6 mm×250 mm，5 μm)。

1.2 材料及试剂

超纯水(贵阳单宁科技有限公司)；对照品：单宁酸粗品(贵阳单宁科技有限公司)，其指示为干燥失重≤ 9.0%， 灼烧残渣质量分数≤ 0.6%， 砷的质量比≤ 3 μg/g，铅的质量比≤ 5 μg/g， 重金属(以Pb计)的质量比≤ 20 μg/g，树胶、糊精试验无浑浊，树脂试验无浑浊，没食子酸质量分数为2.47%，其中除没食子酸含量超过食品级指示(0.75%)，其余均达到食品级指标，单宁酸，比利时Omnichem公司；没食子酸标准品(北京恒元启天化工技术研究院与北京世纪奥科生物技术有限公司联合研制)；色谱纯甲醇(美国天地)；磷酸(安耐吉)；乙酸乙酯(安耐吉)；对照品及供试品均为自行配制。

1.3 实验方法

1.3.1 单因素实验

根据已有研究[15]，不同反萃剂对单宁酸中没食子酸的残留量有一定的关系，因此，选择在25 ℃条件下，考察不同浓度的碳酸氢钠对单宁酸中没食子酸残留量的影响，进行单因素考察实验。

分别称取10 g单宁酸粗品于A、B、C和D瓶中，加入30 mL超纯水，溶解后，搅拌下分别缓慢加入碳酸氢钠 0.8、0.6、0.4、0.2 g，继续搅拌30 min，分别用30、20、10 mL乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯，减压除去乙酸乙酯后，50 ℃真空干燥5 h，得纯品单宁酸DNSCP 9.1 g、DNSCP-1 9.2 g、DNSCP-2 9.1 g和DNSCP-3 9.1 g。

1.3.2 色谱条件与检测方法

采用高效液相色谱方法(HPLC)检测没食子酸的含量[16-18]。C8色谱柱，柱温为30 ℃；DAD检测器调节检测波长为275 nm；甲醇-0.3%磷酸水溶液(体积比为20/80，v/v)等度洗脱；流速为0.6 mL/min；进样量为20 μL。

1.3.3 对照品溶液的制备

精密称取标准品没食子酸0.24 mg于100 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容，摇匀，过0.45 μm 微孔滤膜，即得没食子酸对照品溶液(质量浓度为2.4×10-4mg/μL)。

1.3.4 供试品溶液的制备

精密称取比利时Omnichem公司单宁酸、贵阳单宁科技有限公司单宁酸粗品以及按照1.3.1方法纯化的单宁酸纯品DNSCP、DNSCP-1，DNSCP-2和DNSCP-3对照品适量，加入色谱甲醇配置质量浓度为2.17×10-3、2.00×10-3、2.06×10-3、2.04×10-3、2.07×10-3、2.14×10-3mg/μL的对照品溶液。

2 结果与讨论

2.1 单宁酸纯化方法的确定

根据没食子酸的结构，结合文献[15]的实验结果分析，碱性化合物的选择需满足以下条件：①碱不能水解单宁酸；②碱易与没食子酸完全反应且不易与单宁酸反应；③实验体系中多余的碱易除去。基于此，本实验首先排除使用有机碱，有机碱通常是含氮化合物，易与酚羟基形成氢键，不易完全除去，从而引入新的杂质。对于无机碱，综合经济性、安全性、稳定性的选择原则，选择碳酸氢钠，相比氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾等常用碱具有显著的优势。其理由如下：①氢氧化钠和氢氧化钾是强碱，容易水解单宁酸中的酯键，生成没食子酸；②与碳酸氢钠相比，碳酸钠和碳酸钾不仅价格高，而且其碱性比碳酸氢钠强，有促进单宁酸中酯键水解的风险；③碳酸氢钾与碳酸氢钠性质相似，但碳酸氢钠价格更低。综上分析，碳酸氢钠是最优选择。

2.2 色谱条件的优化

试验前期考察了不同的流动相(甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.3%磷酸水溶液、甲醇-0.5%磷酸水溶液)、流速(0.5、0.6、0.8、1.0 mL/min)、柱温(25、30、35℃)、检测波长190 ～ 400 nm、进样量(5、10、15、20、25 μL)等条件，以色谱峰的分离情况、基线平稳程度、杂质峰的干扰情况等为评价指标，最终确定在275 nm检测波长，30 ℃柱温条件下，进样20 μL，甲醇-0.3%磷酸水溶液以流速0.6 mL/min洗脱为最佳色谱条件。

2.3 线性关系考察

对照品没食子酸溶液2、4、6、8、10 μL按1.3.1节的色谱条件注入高效液相色谱仪。以进样量为横坐标X，峰面积为纵坐标Y进行线性回归，求得线性回归方程y=242.34x+ 49.06，R= 0.999 9(图1)，结果表明峰面积与进样量呈良好的线性关系。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Gallic acid standard curve

2.4 单宁酸中没食子酸含量测定

按1.3.1节色谱条件, 将1.3.2节中制备的样品溶液进样20 μL，HPLC结果如图2所示，其中没食子酸的保留时间为7.9 min，单宁酸的保留时间为5.1 min，重复进样3次，取平均值，根据方程y=242.34x+ 49.06计算没食子酸含量，其结果见表1。

分别取DNSCP、DNSCP-1、DNSCP-2、DNSCP-3样品进行没食子酸含量分析，结果见表1。从中可以看出，DNSCP、DNSCP-1中没食子酸含量低于进口比利时单宁酸中没食子酸含量0.34%，但二者中没食子酸含量差值小，分别为0.15%和0.21%，因此当没食子酸含量低于一定值时，随着碳酸氢钠使用量的增加对单宁酸纯度的提高没有成比例增加，此外，从质量要求和成本考虑，本批次贵阳单宁科技公司的单宁酸使用碳酸氢钠最优质量分数为6%最理想，当碳酸氢钠的用量低于单宁酸质量4%时，其没食子酸含量高于比利时单宁酸。

表1 单宁酸中没食子酸含量分析Tab.1 Analysis of gallic acid content in tannic acid

(a)没食子酸

(b)Omnichem公司单宁酸

(c)贵阳单宁科技公司粗品

(d)贵阳单宁科技公司粗品单宁酸纯化后

2.5 精密度试验

在上述优化的色谱条件下，精密进样单宁酸标准液20 μL，重复5次测定，以峰面积计算系统的精密度，其峰面积分别为19 216.1、19 110.3、19 250.1、19 323.2、19 209.2，结果单宁酸峰面积相对标准偏差RSD为0.4%，说明仪器的精密度良好。

2.6 工艺放大量实验

按上述实验方法，单宁酸的纯化质量放大为160 kg，纯化后的单宁酸中没食子酸质量分数为0.21%，同样实现了没食子酸含量低于比利时单宁酸且超过食品级标准。

3 结论

针对五倍子单宁酸提取物的纯化工艺优化，本研究采用简单易得的无机碱碳酸氢钠选择性去除单宁酸提取物中的主要杂质没食子酸。使用碳酸氢钠处理后的单宁酸，其没食子酸的质量分数从2.47%降低至0.15%，远低于比利时Omnichem公司进口的单宁酸中没食子酸杂质含量。同时为了验证本实验方法的可靠性，将单宁酸的单次纯化量放大至每批次160 kg，结果纯化后的没食子酸质量分数为0.21%，仍低于比利时单宁酸中没食子酸的含量，证明了本方法的实用性。综上，此纯化方法便捷可靠，操作简单，具有巨大的潜在工业应用价值。