臭椿酮对前列腺癌22RV1细胞内源性AR等的影响

暴希照,于效超,牛宗帅,付 霖,李 琦

1.安阳市第八人民医院泌尿外科,安阳 456150;2.郑州大学第一附属医院泌尿外科,郑州 450000

前列腺癌是好发于中老年男性生殖系统的恶性肿瘤[1]。药物去势或手术治疗可在一定程度上缓解前列腺癌患者的病情,但随着病程的进展,大部分患者发展为去势抵抗型前列腺癌（castration-resistant prostate cancer,CRPC）[2],癌细胞增殖加速,导致肿瘤进展,病情恶化。前列腺为雄激素依赖性器官,由雄激素和雄激素受体（androgen receptor,AR）介导的信号途径与前列腺癌的进程关系密切,AR 异常激活是导致CRPC的主要环节[3]。因此,内源性AR 是治疗CRPC的主要靶点。臭椿酮是提取自臭椿的天然小分子化合物。研究显示[4],臭椿酮对非小细胞肺癌细胞的增殖、侵袭具有抑制作用,且呈浓度依赖性,并可促使肺癌裸小鼠肿瘤直径缩小,提示其具有抗癌功效。本研究通过观察臭椿酮对前列腺癌22RV1细胞内源性AR 及其下游基因mRNA 表达的影响,探究其对前列腺癌可能的治疗作用。

1 仪器与材料

1.1 仪器

二氧化碳培养箱、attune nxt流式细胞仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）;37XB型倒置显微镜（上海光学仪器厂）;Spectra Max iD5型酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司];Light Cycler©96型实时荧光定量PCR 仪（罗氏诊断产品有限公司）。

1.2 试药

臭椿酮（体积分数≥98%,上海诚凛生物科技有限公司）;四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）均购自美国Sigma 公司;磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline,PBS,上海康朗生物科技有限公司）;Promega试剂盒、TakaRa荧光定量试剂盒均购自上海拜力生物科技有限公司。

1.3 细胞

前列腺癌22RV1细胞,由上海极威生物科技有限公司提供。

2 方法

2.1 细胞培养和传代

将前列腺癌22RV1细胞接种于RPMI-1640 培养基（含胎牛血清）中,置于培养箱中,隔天换液,待细胞增殖融合贴壁生长达到80%～90%后,采用质量浓度为1.25 g·L-1的胰蛋白酶消化,调整细胞密度后传代,选处于对数生长期的细胞进行实验。

2.2 细胞分组、干预及形态学观察

用质量浓度为1.25 g·L-1的胰蛋白酶消化处于对数生长期的前列腺癌22RV1细胞,以每孔1×105个的密度接种于96孔板,分为对照组、臭椿酮低剂量组、臭椿酮中剂量组和臭椿酮高剂量组,培养至细胞再次贴壁。臭椿酮低、中和高剂量组分别加入不同浓度的臭椿酮,使各孔臭椿酮终浓度分别为0.4、0.8和1.0μmol·L-1,对照组加入等量PBS,每组设置5个复孔,继续放入培养箱中培养48 h。用倒置显微镜（×400）观察培养48 h后的细胞形态变化。

2.3 各组细胞增殖情况测定

用质量浓度为1.25 g·L-1的胰蛋白酶消化传至4～6代的前列腺癌22RV1细胞,以每孔2×103个的密度接种于96孔板,分别以终浓度为0.4、0.8和1.0μmol·L-1的臭椿酮进行干预,各浓度均设置5个复孔。分别于培养箱中培养24、48和72 h,加入新制备的质量浓度为0.5 g·L-1的MTT 溶液,每孔20μL,继续培养4 h 后离心丢弃上清液,每孔加入DMSO 溶液150μL,振荡10 min使结晶充分溶解,继续培养2 h 后吸出上清液,采用酶标仪测定每孔490 nm 处的吸光度（A）。所有实验均重复3次[5]。

2.4 各组细胞凋亡率的测定

用质量浓度为1.25 g·L-1的胰蛋白酶消化各组培养72 h的前列腺癌22RV1细胞,用PBS溶液洗涤细胞3次,重悬后以2 800 r·min-1离心10 min后丢弃上清液,用少量PBS溶液吹开并混匀沉淀,加入预冷乙醇2 mL,于4℃过夜。次日离心丢弃上清液,用PBS溶液洗涤细胞3次,加入Annexin V-APC 5μL、Propidium Iodide 5μL后充分混合均匀,室温下避光孵育10 min,过滤,用流式细胞仪对各组细胞的凋亡率进行测定。

2.5 各基因引物序列的测定

用实时荧光定量PCR 仪检测各组细胞AR、下游基因前列腺特异性抗原（prostate specific antigen,PSA）、FK506结合蛋白5（FK506 binding protein 5,FKBP5）、溶质转运蛋白家族45A3（solute carriers 45A3,SLC45A3）、N-myc下游调节基因1（N-myc downstream regulated gene 1,NDRG1）mRNA 的表达水平。收集培养72 h的22RV1细胞,按照Trizol说明书操作步骤提取各组细胞总RNA,经Promega试剂盒逆转录后获取cDNA,对cDNA 进行定量检测后实施PCR 扩增,根据TaKaRa荧光定量试剂盒说明书设定反应体系。反应条件为:95℃预变性10 min,95℃变性30 s,64℃退火30 s,70℃延伸30 s,重复43个循环。内参基因为β-actin,目的基因相对表达强度为2-△△Ct,重复3次取Ct平均值。引物序列见表1。

表1 各基因引物序列Tab.1 Primer sequences of each gene

2.6 统计学方法

采用SPSS 22.0处理、分析数据,计量资料以均数±标准差（）表示,以单因素方差分析比较多样本资料,两两样本资料比较采用Snk-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组细胞形态学观察

不同浓度臭椿酮干预48 h后细胞形态出现显著变化:对照组细胞的生长状态旺盛,细胞之间紧密接触、贴壁生长,且轮廓清晰、分裂相多;臭椿酮低剂量组细胞的生长被抑制,分裂相减少;臭椿酮中剂量组细胞的生长被显著抑制,仅少数细胞贴壁生长,分裂相显著减少,折光性弱,部分细胞死亡;臭椿酮高剂量组细胞死亡数量显著增加,活细胞数量显著减少。结果见图1。

3.2 各组细胞增殖情况比较

各组24、48、72 h MTT 实验A值比较,差异均具有统计学意义（P＜0.05）;臭椿酮高、中和低剂量组MTT 实验A值均低于对照组,臭椿酮高剂量组MTT 实验A值均低于臭椿酮低、中剂量组,臭椿酮中剂量组MTT 实验A值低于臭椿酮低剂量组,差异均具有统计学意义（P＜0.05）;各组MTT 实验A值均随处理时间的延长呈显著上升趋势（P＜0.05）。结果见表2。

表2 各组细胞不同时刻增殖情况比较 （,n=5）Tab.2 Comparison of cell proliferation at different times among different groups （,n=5）

表2 各组细胞不同时刻增殖情况比较 （,n=5）Tab.2 Comparison of cell proliferation at different times among different groups （,n=5）

注:与对照组比较,a P＜0.05;与臭椿酮低剂量组比较,b P＜0.05;与臭椿酮中剂量组比较,c P＜0.05;与24 h比较,d P＜0.05;与48 h比较,e P＜0.05。

3.3 各组细胞凋亡率比较

干预72 h后对照组及臭椿酮低、中和高剂量组细胞的凋亡率分别为2.09%±0.65%、12.86%±1.12%、39.31%±2.83%、52.63%±2.9%,细胞凋亡率组间比较,差异有统计学意义（F=588.546,P=0.000）;臭椿酮低、中和高剂量组凋亡率均高于对照组（q=18.597、20.923、37.291,P=0.000）,臭椿酮高剂量组高于臭椿酮低、中剂量组（q=28.099、7.273,P=0.000）,臭椿酮中剂量组高于臭椿酮低剂量组（q=19.432,P=0.000）。结果见图2。

3.4 各组细胞AR、PSA、FKBP5、SLC45A3、NDRG1 mRNA表达水平比较

AR、PSA、FKBP5、SLC45A3、NDRG1 mRNA的相对表达量组间比较,差异均具有统计学意义（P＜0.05）;臭椿酮低、中和高剂量组AR、PSA、FKBP5、SLC45A3 m RNA 的相对表达量均低于对照组,臭椿酮高剂量组低于臭椿酮中、低剂量组,臭椿酮中剂量组低于臭椿酮低剂量组,差异均具有统计学意义（P＜0.05）;臭椿酮低、中和高剂量组NDRG1 mRNA的相对表达量均高于对照组,臭椿酮高剂量组高于臭椿酮中、低剂量组,臭椿酮中剂量组高于臭椿酮低剂量组,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结果见表3。

表3 各组细胞AR、PSA、FKBP5、SLC45A3、NDRG1 mRNA表达水平比较 （,n=5）Tab.3 Comparison of m RNA expression of AR,PSA,FKBP5,SLC45A3,and NDRG1 among different groups（,n=5）

表3 各组细胞AR、PSA、FKBP5、SLC45A3、NDRG1 mRNA表达水平比较 （,n=5）Tab.3 Comparison of m RNA expression of AR,PSA,FKBP5,SLC45A3,and NDRG1 among different groups（,n=5）

注:与对照组比较,a P＜0.05;与臭椿酮低剂量组比较,b P＜0.05;与臭椿酮中剂量组比较,c P＜0.05。

4 讨论

前列腺癌发病原因多样,与年龄、家族史、肥胖、饮食、饮酒、首次遗精年龄及性生活频率等因素均有关[6-7]。目前其发病机制尚不明确,但有研究者认为,雄激素和AR 信号的作用与前列腺癌的发生相关[8-9]。AR 是前列腺癌发生、发展的核心调控因子,其过表达和分子过度激活与该病发展的关系密切,是导致CRPC的重要因素,显著影响其预后[10]。因此,临床医师逐渐将注意力转向AR 靶向治疗及相关药物的研究。

本研究发现,臭椿酮低、中和高剂量组细胞的生长受到抑制,细胞数量减少;臭椿酮低、中和高剂量组MTT 实验A值均低于对照组,凋亡率均高于对照组,均具有剂量依赖性,提示臭椿酮可抑制前列腺癌22RV1细胞的增殖,并促使其凋亡,且具有剂量依赖性。臭椿酮具有多种生物学活性,可抗疟疾、抗溃疡、抗过敏、抗微生物,且能促进自身免疫力的提升进而起到多种治疗功效[11-12]。此外,臭椿酮可抑制由缺失配体结构域及双氢睾酮诱导的AR 活性,从而抑制前列腺癌细胞的生长。陈小宇等[13]研究发现,臭椿酮可能通过抑制PI3K/Akt信号通路诱导人黑色素瘤A375细胞的凋亡。另有研究通过反向分子对接技术和网络药理学分析,发现臭椿酮的靶蛋白中有11个富集于前列腺癌通路中,臭椿酮有望成为治疗前列腺癌的有效药物[14]。

本研究中臭椿酮低、中和高剂量组AR、PSA、FKBP5、SLC45A3 mRNA 的相对表达量均低于对照组,且3 组依次降低;臭椿酮低、中和高剂量组NDRG1 m RNA 的相对表达量均高于对照组,且3组依次升高,推测臭椿酮可通过调控AR 及其下游相关基因的表达,从而调控前列腺癌22RV1细胞的增殖和凋亡。PSA 为人组织型激肽释放酶家族成员,与雄激素结合后可激活AR 和PSA 蛋白的表达,经前列腺上皮细胞释放入血[15-16]。有文献指出[17],AR 正调控PSA 的同时可被PSA 反馈激活,进而调控AR的表达。FKBP5属于亲免素蛋白家族成员,其实质为雄激素调节基因,在AR 信号通路中扮演着重要角色。SLC45A3为前列腺癌特异性雄激素应答基因,经前列腺癌患者雄激素R1881诱导,其处于异常高表达状态[18]。NDRG1是N-myc下游调节基因,异常低表达于乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤组织中,研究发现其可作为肿瘤抑制因子参与肿瘤恶性转化、转移的调控[19-20]。臭椿酮可阻断AR 结合其分子伴侣复合体,降低AR 蛋白稳定性进而被蛋白酶体降解,从而显著下调AR 并削弱其转录活性,进而调控其下游基因PSA、FKBP5、SLC45A3、NDRG1的表达,发挥抗肿瘤效应。

综上所述,臭椿酮可促使前列腺癌22RV1细胞发生形态学变化,抑制其增殖,促使其凋亡,且表现为剂量依赖性,推测该药物可能通过下调内源性AR 及其下游基因PSA、FKBP5、SLC45A3 m RNA 的表达,上调NDRG1 m RNA 的表达发挥抑制前列腺癌细胞增殖的作用。