姜黄素对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞增殖及VEGF和NF-κB p65表达的抑制作用

项 彪，潘颖喆，谢安琪，程 希，邓 玲

0引言

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常见的慢性微血管并发症之一。DR导致视力下降甚至失明最主要的阶段是增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)。流行病学调查表明，DR诊断25a后，PDR的患病率接近50%，且大多数1型糖尿病(T1DM)患者将在大约10a后发展为PDR[1]，其病理学特征主要为晚期组织缺血缺氧，诱导多种促血管生成因子和炎症因子的释放增加，导致新生血管的形成，从而继发玻璃体积血和视网膜脱离引起患者视力丧失[2]。在DR的发生发展进程中，VEGF和NF-κB起着非常关键的作用。其中，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)被认为是促进血管生成的最主要因子，也是抗血管生成的重要靶点[3]。研究发现，PDR患者玻璃体和纤维血管组织中的VEGF水平显著高于正常眼[4]。核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是一种多向性核转录因子，广泛参与机体的免疫、炎症等生理病理过程[5]。研究发现，DR高血糖状态可引起活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成增加，从而介导大量的炎症因子释放，而炎症因子和ROS水平上调又可进一步激活NF-κB，导致视网膜低度炎症[6]。姜黄素(curcumin，Cur)是一种从姜科植物姜黄中提取的主要的多酚类活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用，尤其在抗肿瘤方面具有较强的功效，能通过下调VEGF的表达抑制肿瘤新生血管的形成[7-8]。研究还发现，姜黄素显著降低脂质过氧化，增加细胞内抗氧化剂含量，调节抗氧化酶，并清除高血糖诱导的ROS产生[9]。但其对于高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞(human retinal capillary endothelial cells，HRCECs)是否也能通过降低VEGF、NF-κB的表达而发挥治疗作用尚不明确。因此，本研究通过CCK-8细胞增殖实验、Western-blot及免疫细胞化学法，探讨姜黄素对于高糖诱导的HRCECs作用的潜在机制。

1材料和方法

1.1材料HRCECs(上海中科院细胞库)；低糖/高糖DMEM培养基(美国Gibco公司)；姜黄素、胰酶(美国Sigma公司)；CCK-8细胞增殖试剂盒(上海碧云天生物公司)；兔抗人VEGF多克隆抗体，兔抗人NF-κB多克隆抗体，兔抗人血管内皮生长因子IgG，蛋白预染Marker，BCA蛋白浓度测定试剂盒(武汉博士德生物公司)；倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；全自动酶标仪(美国Bio-Rad公司)。本研究经襄阳市第一人民医院医学伦理委员会审核通过。

1.2方法

1.2.1姜黄素溶液的配置姜黄素，纯度>95%，称取14.2mg姜黄素粉末溶解于1mL 100%的二甲基亚砜(DMSO)溶剂中，根据C=m/M.V，配制成浓度为40mmol/L的姜黄素母液，除菌分装后保存在-20℃冰箱中。临用前，用DMEM高糖培养基稀释至实验所需浓度，DMSO终浓度<0.1%。

1.2.2细胞处理及分组将HRCECs置于含有青/链双抗、胎牛血清的DMEM培养基中，放入培养箱中培养。取处于对数生长期的细胞进行实验分组：空白组(G0组，只含高糖DMEM培养基的调零组)，正常对照组(NG组，低糖DMEM培养基+细胞)，高糖对照组(HG组，高糖DMEM培养基+细胞)，G1组(高糖DMEM培养基+细胞+20μmol/L姜黄素)，G2组(高糖DMEM培养基+细胞+40μmol/L姜黄素)，G3组(高糖DMEM培养基+细胞+80μmol/L姜黄素)。正常糖浓度的DMEM培养基葡萄糖浓度为5.5mmol/L，统称为低糖培养基；高糖DMEM培养基中葡萄糖浓度为25mmol/L；G0组仅设于CCK-8实验。

1.2.3CCK-8法检测HRCECs增殖取对数生长期且长势良好的HRCECs用于实验，将细胞经PBS洗涤、胰酶消化、离心后，用DMEM培养基制成浓度为5×104cell/mL的单细胞悬液，以每孔200μL将悬液接种于96孔板内，每组设5个复孔，培养至细胞贴壁。按照上述分组分别培养12、24、48h，向每孔加入CCK-8溶液10μL，37℃孵育4h后，用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光度值(A值)，计算每组浓度复孔平均值及细胞增殖抑制率，上述实验重复3次。细胞抑制率(%)=[(对照组平均A值-加药组平均A值)/(对照组平均A值-空白组平均A值)]×100%。

1.2.4Western-blot法检测HRCECs中蛋白的表达收集各组处理24h后的HRCECs用PBS洗涤，加入适量的RIPA裂解液4℃下反应20min以提取细胞总蛋白。加入1/5体积的5×蛋白上样缓冲液，置于100℃沸水中10min。BCA法检测蛋白浓度。按照每孔50μg上样量进行SDS-PAGE电泳。恒流300mA电转90min后，用5%的脱脂牛奶室温下封闭60min。然后分别加入经TBST液稀释的VEGF、NF-κB和β-actin一抗4℃孵育过夜，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温下孵育1h。采用Image J软件测定灰度值，计算A值，以β-actin为内参计算蛋白相对表达量。

1.2.5免疫细胞化学法检测HRCECs中蛋白的表达将预先消毒灭菌的盖玻片放入6孔板内，制备浓度为5.0×104cell/mL的单细胞悬液，每孔内滴入2mL悬液，培养48h后弃液，按照分组加入不同的条件培养液，共5组：NG组、HG组、G1～G3组，每组设2个复孔，继续培养24h后取出盖玻片，用PBS洗涤、4%多聚甲醛室温固定15min。再经PBS洗涤，0.1%Triton-X100室温通透化处理15min作染色前处理。然后在3%过氧化氢-甲醇溶液中浸泡30min，以灭活内源性过氧化物酶，用PBS液洗涤后，再将其置于二抗来源的非免疫兔血清湿盒中封闭30min，去除血清后甩干；加入一抗(兔抗人VEGF 1∶200)，同时用PBS代替一抗设为阴性对照组，4℃湿盒中过夜，室温下复温30min，PBS液洗涤，加入生物素标记的二抗37℃孵育1h。最后，经SABC法染色、DAB显色、苏木素复染、乙醇梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，干燥后显微镜下观察。上述实验重复3次。计算各组标本灰度值：阳性灰度值与背景灰度值之差。

2结果

2.1CCK-8法检测姜黄素对高糖诱导的HRCECs增殖能力的影响干预不同时间各组A450比较，差异有统计学意义(F组间=687.00，F时间=179.50，F交互=26.74，均P<0.001)。与NG组相比，HG组中HRCECs增殖能力显著增强(P<0.01)，随着干预时间的延长而增强。增殖抑制率随着药物的浓度增加而上升，具有浓度依赖性。在相同药物浓度作用下，随着干预时间的延长，细胞增殖能力减弱(P<0.01)，细胞增殖抑制率逐渐上升，具有时间依赖性。结果表明，高糖环境下的HRCECs增殖能力显著增强，而姜黄素对高糖诱导的HRCECs增殖有明显抑制作用，且随着浓度的增加、干预时间的延长抑制作用增强，见表1，图1。

表1 不同浓度姜黄素作用不同时间后对高糖诱导的HRCECs增殖的影响

图1 不同浓度姜黄素作用不同时间后对高糖诱导的HRCECs增殖抑制率的影响。

2.2Western-blot法检测姜黄素对高糖诱导的HRCECs中VEGF-A和NF-κBp65表达的影响实验结果显示：与NG组比较，HG组中VEGF-A、NF-κB p65的表达显著升高(P<0.01)；与HG组比较，G1～G3组中VEGF-A、NF-κB p65的表达均显著下降(P<0.01)；在相同药物浓度作用下，随着干预时间延长，HRCECs中VEGF-A、NF-κB p65的表达呈下降趋势(P<0.01)；在相同干预时间下，HG组与G1～G3组之间两两比较，随着姜黄素浓度增加，HRCECs中VEGF-A、NF-κB p65的表达呈下降趋势(P<0.01)。结果表明，姜黄素对高糖诱导的HRCECs中VEGF-A、NF-κB p65的表达具有下调作用，且在药物浓度范围内呈剂量-时间依赖性，见表2、3，图2～4。

表2 高糖诱导的HRCECs经不同浓度姜黄素干预12、24、48h后VEGF-A的表达

图2 姜黄素作用12h后对高糖诱导的HRCECs中VEGF-A和NF-κB p65表达的影响。

图3 姜黄素作用24h后对高糖诱导的HRCECs中VEGF-A和NF-κB p65表达的影响。

图4 姜黄素作用48h后对高糖诱导的HRCECs中VEGF-A和NF-κB p65表达的影响。

2.3免疫细胞化学法检测姜黄素对高糖诱导的HRCECs中VEGF表达的影响VEGF的表达主要存在于HRCECs的细胞膜及细胞浆中，阳性表现为棕褐色颗粒着染。灰度值结果示，与NG组比较，HG组HRCECs中VEGF的表达明显增多(P<0.01)。不同浓度姜黄素干预24h后与HG组比较，HRCECs中VEGF表达明显减少(P<0.01)，随着药物浓度增加，细胞膜及细胞浆中的棕褐色阳性着染逐渐减少，颜色变淡，不同浓度加药组之间两两比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。表明姜黄素能有效抑制HRCECs中VEGF的表达，且随着药物浓度增加抑制作用增强，上述结果与Western-blot结果相符，见表4、图5。

图5 免疫细胞化学法检测姜黄素对高糖诱导的HRCECs中VEGF表达的影响。

3讨论

视网膜新生血管(retinal neovascularization ,RNV)是DR患者病情恶化、视力丧失的主要原因，其发生发展与HRCECs的增殖、VEGF及NF-κB表达上调之间关系密切。

表3 高糖诱导的HRCECs经不同浓度姜黄素干预12、24、48h后NF-κB p65的表达

表4 姜黄素作用24h后各组HRCECs中VEGF的表达

新生血管的形成过程十分复杂，主要包括血管基底膜降解、内皮细胞增殖、迁移、成管四个阶段。研究发现，长期高糖环境对不同组织的血管内皮细胞影响不同，对大血管内皮细胞主要表现为抑制其生长，而对微血管内皮细胞反而表现为促进其增殖[10]。本实验结果也提示，高糖环境下，HRCECs的增殖能力显著增强，与既往文献报道相符[11]；在给予不用浓度姜黄素干预后，可明显降低HRCECs的增殖能力，且抑制作用随着药物浓度增加、干预时间延长而增强。表明高糖诱导的HRCECs增殖能力增强，而姜黄素对其可有效抑制。

参与调控RNV形成的细胞因子众多，血管生成因子(如VEGF)起刺激作用，血管抑素和色素上皮衍生因子(PEDF)起抑制作用[12]。正常环境下，各种因子保持动态平衡。但在高血糖、氧化应激及非感染性炎症反应等病理状态时，平衡状态会被破坏，促使血管生成的主要因子VEGF表达上调[13]。VEGF与其受体结合后，可激活下游的PI3K/Akt、p38及Raf等通路，来调控内皮细胞的增殖。本实验中Western-blot和免疫细胞化学法结果均显示，HG组细胞中VEGF的表达量较NG组显著增加，表明一定浓度范围内高糖环境可上调VEGF的表达，与既往文献报道相符[11]。姜黄素在抗新生血管形成方面的作用已经得到了证实。研究发现，姜黄素能通过调控VEGF信号通路诱导氧化应激和抑制血管生成，在结直肠癌的治疗上发挥作用[8]。李勇等[7]研究发现，姜黄素可通过降低VEGF的表达水平，抑制肝癌组织缺氧诱导的血管形成和肝癌细胞生长转移。本实验采用不同浓度姜黄素处理高糖诱导的HRCECs后发现，加药组细胞VEGF的表达显著下降，且呈浓度与时间依赖性。结合CCK-8结果，表明姜黄素抑制体外高糖诱导的HRCECs增殖可能与VEGF表达下调有关。

NF-κB是一种关键的促炎转录因子，其信号通路的激活是DR炎症反应发生发展过程中的关键一步。在PDR患者中，高血糖介导的ROS生成增加、NF-κB激活与VEGF上调之间关系显著[14]。研究发现，高糖环境下氧化应激诱导的ROS上调和非酶糖基化产物与其受体的结合，均能引起NF-κB的持续激活[6,15]。正常情况下，NF-κB在胞浆中与抑制蛋白(I-κB)结合处于失活状态。当受到刺激时，I-κB激酶发生磷酸化，导致游离的NF-κB易位到细胞核，与特定的基因序列结合，诱导多种促炎因子、黏附因子、炎性酶、趋化因子等表达，从而促进炎症发生、细胞增殖和血管生成[5]，表明NF-κB的激活是始动事件，随后其他炎症通路的激活逐步导致了DR微血管损伤。研究还发现NF-κB通路的激活能诱导VEGF的表达[16]。姜黄素对NF-κB通路的抑制作用已在多种细胞中被报道。研究发现，姜黄素能通过抑制I-κB激酶和NF-κB活性诱导慢性粒细胞白血病细胞的KCL-22细胞凋亡[17]，其机制可能是由姜黄素自身的抗炎、抗氧化等药理特性改变了细胞的微环境和对ROS水平的调控。本研究中Western-blot结果示HG组细胞中NF-κB p65的表达量较NG组显著增加，表明NF-κB通路在DR进展过程发挥着重要作用，与既往文献报道相符[11]。在给予不用浓度姜黄素干预后，加药组细胞NF-κB p65的表达显著下降，且呈浓度与时间依赖性。结合CCK-8结果，表明姜黄素抑制体外高糖诱导的HRCECs增殖可能与NF-κB p65表达下调有关。

综上所述，本实验证实姜黄素能抑制高糖诱导的HRCECs增殖，其机制可能与其下调HRCECs中VEGF-A、NF-κB p65的表达有关。但本实验仅是体外实验，而且关于RNV的生成因素只考虑了VEGF和NF-κB，实际上DR的发病机制复杂，参与的细胞因子众多，是多种因素相互作用的结果。本实验尚未明确姜黄素抑制VEGF、NF-κB表达的具体机制，及它们间的相互作用关系。姜黄素对高糖诱导的HRCECs增殖及VEGF、NF-κB p65表达的抑制作用的具体机制等问题有待进一步实验进行深入研究。