聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶构建新型组织工程瓣膜支架*

徐 旭， 洪 昊， 乔韡华， 史嘉玮， 董念国

华中科技大学同济医学院附属协和医院心脏大血管外科，武汉 430022

目前临床上广泛使用的戊二醛交联的生物瓣膜具有良好的力学性能，但是由于戊二醛的细胞毒性，戊二醛瓣膜常因再细胞化困难而导致瓣膜衰败[1]。组织工程瓣膜具有良好的生物相容性，能够在体内发生组织重塑，有望成为下一代瓣膜替代物。去细胞瓣膜是目前常用的组织工程瓣膜支架，具有天然的瓣膜结构，有利于细胞的粘附、生长和增殖[2]。但是去细胞瓣膜力学性能弱，无法承受心脏内巨大的血流压力。聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶具有良好生物相容性，其双交联的网络结构使水凝胶具有良好的韧性。但是单纯的聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶构建组织工程瓣膜支架，难以模拟天然瓣膜复杂的结构。因此，我们利用聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶交联去细胞瓣膜构建新型组织工程瓣膜支架，并对其生物学性能和生物力学性能进行研究。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂与仪器

聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA，700DA)、海藻酸钠、Irgacure 2959购自上海麦克林公司；磷酸盐缓冲液(PBS)、DMEM培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司；CHAPS、Tris-HCl、TnBP、SB3-10、ASB-14、Benonase购自美国Sigma公司；25%戊二醛购自国药集团化学试剂有限公司；CCK8试剂盒购自Biosharp公司；猪主动脉瓣叶购自武汉市肉联厂；扫描电镜为荷兰FEI公司产品；拉力测试仪为美国Instron公司产品。

1.2 聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶预混液的制备

配置40%(W/W)PEGDA溶液和5%(W/W)海藻酸钠溶液，将上述PEGDA溶液与海藻酸钠溶液按照1∶1加入，用磁力搅拌器混合10 min。接着将Irgacure 2959作为光交联剂加入上述混合溶液中。

1.3 去细胞瓣膜的制备

配制体系1溶液：含40 mmol/L Tris-HCl(pH=7.8)，2%(W/V)CHAPS，2 mmol/L TnBP；配制体系2溶液：含40 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH=7.8)，2 mmol/L TnBP，2%(W/V)CHAPS，2%(W/V)SB3-10和1%(W/V)ASB-14；配制核酸酶溶液：50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH=7.8)，100 U/mL Benzonase和1 mmol/L MgCl2。新鲜的猪主动脉瓣叶用PBS漂洗30 min。漂洗后的主动脉瓣叶顺序置于体系1溶液、体系2溶液、核酸酶溶液中各反应24 h，在每次反应完成后置于PBS溶液中漂洗24 h，每6 h换1次PBS(上述步骤均在37℃，110 r/min的恒温摇床上进行)。

1.4 复合支架瓣膜的制备

将去细胞瓣膜放置在聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶预混液中静置10 min，取出放置在波长为365 nm紫外灯下照射20 min(正反两面各照射10 min)进行光交联，然后再置于1 mmol/L CaCl2溶液中交联24 h。此瓣膜即为复合支架瓣膜样本(复合支架组)。

1.5 戊二醛瓣膜的制备

将猪主动脉瓣叶放置于PBS溶液中漂洗30 min，随后放置在0.25%戊二醛溶液中37℃下交联24 h。交联完成的瓣膜存放在4℃，0.125%戊二醛溶液中。此瓣膜即为戊二醛交联瓣膜样本(戊二醛组)。

1.6 组织学染色

将两组瓣膜(5片/组)放置在4%多聚甲醛中固定15 min后，复合支架组行冰冻切片，戊二醛组行石蜡包埋切片。将两组切片行苏木精-伊红(HE)、马松(Masson)、弹性纤维范吉森(EVG)染色，观察各组瓣膜组织学染色情况。

1.7 大体和扫描电镜观察

将两组瓣膜置于黑色背景下，拍摄其交联后的外观。将两组瓣膜(5片/组)分别于梯度浓度的乙醇溶液中脱水后，置于-80℃冰箱过夜。冰冻干燥真空机预冷后，将瓣膜放置机器内干燥12 h。干燥完成后，对瓣膜行喷金处理，即可进行扫描电镜观察、拍摄。

1.8 细胞增殖实验

将两组瓣膜(5片/组)均裁剪成直径为6.35 mm的圆片，0.1%过氧乙酸浸泡4 h，PBS漂洗30 min。将经上述灭菌处理后的瓣膜片放置于96孔板中，每孔加入200 μL细胞密度为1×104/mL的脐静脉内皮细胞，以含10%胎牛血清的DMEM培养液在37℃，5% CO2的培养箱中进行培养。在第1、3、5天时，将瓣膜转移至新的96孔板中，每孔加入200 μL CCK8试剂孵育3 h，用酶标仪测量每孔溶液在450 nm处的吸光度值(A)。

1.9 生物力学性能测试

将两组瓣膜(5片/组)分别沿着瓣膜的长轴裁剪成3 mm × 15 mm的矩形，将矩形瓣膜片固定在拉力测试仪的夹片上，以5 mm/min的速度拉伸瓣膜。记录每片瓣膜的杨氏模量、最大应力和最大应变。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 组织学染色

组织学染色显示复合支架组中去细胞瓣膜脱细胞完全，无细胞残留；胶原蛋白和弹性蛋白保留完好；聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶均匀地结合在去细胞瓣膜表面。戊二醛组胶原蛋白排列结构更加致密，弹性蛋白保留完全(图1)。

黑色箭头标注为聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶；标尺长度：100 μm图1 两组瓣膜的组织学染色Fig.1 Histological staining of valve tissues in two groups

2.2 大体和扫描电镜观察

两组瓣膜大体观显示戊二醛组瓣膜发黄和轻微皱缩，而复合支架组中所用聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶未使去细胞膜的颜色和形状发生明显改变。电镜结果显示戊二醛组表面致密，而复合支架组表面呈现粗糙的微结构(图2)。

图2 两组瓣膜的扫描电镜和大体观察Fig.2 Scanning electron micrographic result and general observation of the two groups

2.3 细胞增殖

复合支架组瓣膜表面的细胞生长良好，细胞数量随培养天数增加而不断增加。而戊二醛组瓣膜表面细胞生长状况较差，细胞数量随培养天数的增加呈下降趋势(图3)。

与复合支架组比较，**P<0.01图3 HUVECs在两组瓣膜表面数量随培养时间的变化Fig.3 Changes in number of HUVECs on the surface of valves in the two groups over time

2.4 力学性能

戊二醛组在杨氏模量和最大应力方面明显高于复合支架组(均P<0.05)。在最大应变上，复合支架组显著强于戊二醛组(P<0.05)(图4)。

与复合支架组比较，*P<0.05 **P<0.01图4 两组瓣膜的生物力学性能比较Fig.4 Comparison of biomechanical properties between the two groups

3 讨论

组织工程瓣膜具有组织再生和自我更新的能力，能够提高瓣膜替代物的使用寿命。未来，组织工程瓣膜将有可能取代目前临床常用的戊二醛生物瓣。

聚乙二醇水凝胶因具有良好细胞相容性，无免疫原性以及类似软组织的三维结构而被广泛应用于组织工程领域[3]。既往有研究将聚乙二醇水凝胶与去细胞瓣膜交联促进细胞生长，但结果表明聚乙二醇水凝胶交联去细胞瓣膜后，去细胞瓣膜的生物力学性能并未得到提高[4]。另有研究发现由聚乙二醇和海藻酸钠构成的互穿网络水凝胶具有良好的弹性和力学强度[5]。因此，本研究将聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶与去细胞瓣膜进行交联构建新型组织工程瓣膜支架，并对其生物学和生物力学性能进行研究。有研究表明疏松多孔的结构更有利于营养物质与代谢产物的交换，更利于细胞的生长[6]。本研究组织学染色结果显示复合支架瓣膜内结构较戊二醛瓣膜更加疏松多孔，这说明复合支架瓣膜较戊二醛瓣膜更有利于细胞生长。同时，我们可以观察到去细胞瓣膜表面结合上了聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶，其结合的方式可能是瓣膜上的氨基与水凝胶上丙烯酸酯双键发生迈克尔加成反应[7]。这说明聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶能与去细胞瓣膜产生紧密结合。既往研究表明瓣膜皱缩可能会导致瓣膜替代物衰败。本研究中两组瓣膜大体观显示戊二醛交联的瓣膜有些许皱缩，这将促进瓣膜的衰败[8]；而复合支架瓣膜中聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶没有对瓣膜颜色和形状产生明显影响。既往有研究表明粗糙的微结构表面将有利于细胞的粘附和增殖[9]。本研究扫描电镜结果显示复合支架瓣膜表面更加粗糙，而戊二醛组瓣膜表面致密和平整，提示复合支架瓣膜更有利于细胞的粘附和增殖。本研究细胞增殖实验表明复合支架组较戊二醛组瓣膜表面细胞生长状态好，而且随着培养时间的延长，复合支架组细胞数量不断增加，但戊二醛组细胞数量呈现下降趋势。这证实了复合支架瓣膜内部的疏松结构和表面粗糙的微结构促进了细胞的生长，同时也说明聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶具有良好的生物相容性，对细胞没有毒性。戊二醛组细胞生长不良，其原因可能因为戊二醛对细胞的毒性，以及致密的瓣膜结构不利于细胞的增殖[10]。

本研究通过杨氏模量和最大应力来评价瓣膜的生物力学性能，结果显示戊二醛瓣膜组均优于复合支架组。而在最大应变上，复合支架组优于戊二醛组。已有研究表明，聚乙二醇-海藻酸钠构成的互穿网络水凝胶具有良好的弹性，当水凝胶受到外力时，以离子键结合的海藻酸钠网络分开以抵消外力产生的机械能；当外力消失时，以共价键结合的聚乙二醇链可使水凝胶回复原有形状[5]。因此，复合支架瓣膜中的聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶使去细胞瓣膜具有良好的形变能力。瓣膜的开和关决定心脏内血流的方向，瓣膜的开和关的过程不仅需要瓣膜具有良好的力学强度，还需要其具有好的应变性能[11]。本研究结果显示，复合支架组在最大应变上较戊二醛组有显著优势。

综上所述，由聚乙二醇-海藻酸钠水凝胶交联去细胞瓣膜构建的新型组织工程瓣膜支架具有良好的生物相容性与生物力学性能，具有成为下一代瓣膜替代物的潜能。接下来，我们将进一步研究此复合瓣膜支架在体内的生物相容性，并进一步改善此复合瓣膜支架的生物力学强度。