KCNH2基因c.358G>T突变导致家族性长QT综合征的实验研究*

陈 嫣， 王 宏， 宋秀丽， 樊静静， 孙 阳， 汪道文， 杨晓云

华中科技大学同济医学院附属同济医院心血管内科，武汉 430030

先天性长QT综合征(long QT syndrome，LQTS)是一种罕见的遗传性心脏疾病，其遗传方式主要包括常染色体显性遗传与常染色体隐性遗传。据统计，每2500个新生儿中可能会有1个人被诊断为LQTS[1]。目前LQTS中已有20余种突变基因被发现，最常见的主要包括LQT1、LQT2和LQT3三个亚型，约占LQTS患者的90%。LQT1致病基因为编码心脏缓慢延迟整流钾电流(IKs)通道的KCNQ1基因，LQT2致病基因为编码心脏快速延迟整流钾电流(rapidly activated delayed rectifier potassium current，IKr)通道α亚基的KCNH2基因，LQT3致病基因为编码心脏电压门控钠通道(Nav1.5)α亚基的SCN5A基因。LQTS的静息心电图可表现为QT间期延长，患者因心肌复极异常而有发生恶性室性心律失常的风险[2]。有1/3以上基因突变携带者静息心电图QT间期正常[3]，但首发表现可能就是心源性猝死(sudden cardiac death，SCD)。因此，LQTS的诊断具有极大的挑战性。近年来，随着基因检测技术在临床工作中的不断推广，LQTS基因阳性诊断率越来越高，与基因突变相关的家族性LQTS也越来越受到人们的重视。临床上除了对疑似LQTS患者进行相关检查外，对已知LQTS患者突变的分子遗传学和一级家族成员的筛查均有助于提高诊断的可信度。此外，LQTS的突变基因筛选还可识别无症状和表型阴性的LQTS个体，避免这些潜在患者因服用可致QT间期延长的药物而遭受额外的外源性伤害。因此，对LQT2患者的致病基因、发病机制及其家族遗传背景的不断深入研究，对于防止不良心血管事件的发生具有重要的临床意义。

1 材料和方法

1.1 主要仪器和试剂

Nanodrop 2000、超纯水仪和细胞培养箱(Thermo Fisher，美国)；高速冷冻离心机(美国Eppendorf公司)；PCR仪器、Qubit 2.0定量仪与10n PGM测序仪(美国Life Technologies公司)；超低温冰箱(中国海尔)；琼脂糖凝胶电泳系统(北京市六一仪器厂)；紫外核酸检测仪(北京市六一仪器厂)；普通倒置显微镜、荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)；Western blot装置(美国Bio-Rads公司)；膜片钳放大器、数据采集系统程序(美国AXON公司)；显微操纵器、微电极拉制仪P1000、微电极拉制仪加热片、微电极玻璃管(美国Sutter公司)；荧光显微镜(日本Nikon公司)。

血液基因组DNA提取试剂盒(南京诺维赞生物科技有限公司)；建库试剂盒(美国Life Technologies公司)；Qubit dsDNA高浓度测定试剂盒和Supplies 200 v2试剂盒(美国Life Technologies公司)；Beckman磁珠(美国Beckman公司)；人胚肾293细胞(HEK293)为实验室既往冻存的细胞株(ATCC来源)；DMEM培养液和胎牛血清(美国Gibco公司)；Western blot制胶套装、NP40细胞裂解液(中国博士德有限公司)；BCA蛋白浓度检测试剂盒、ECL显影液、细胞转染试剂Lipo2000(美国Thermo Fisher公司)；蛋白Marker(中国金斯瑞公司)；PVDF膜(德国Dassel公司)；GAPDH抗体、KCNH2抗体(Abclonal公司)。

1.2 LQTS家系收治和临床数据收集

收集在华中科技大学同济医学院附属同济医院心血管内科门诊就诊的多个LQTS家系的病例资料，并对相应家庭成员进行检测及随访。所有家系成员都同意并签署了知情同意书。在严格保护所有成员隐私的前提下，详细询问患者平时出现相关症状的具体情况，如晕厥或猝死发生的时间、次数、具体症状、转归等，然后进行相关体格检查和实验室检查，包括常规心电图、长程心电图、超声心动图等。每个患者及家属各采集5 mL静脉血，800 r/min离心分离血浆和白细胞后保存于-80℃冰箱，用于后续基因检查。华中科技大学同济医学院伦理委员会批准了本研究。

1.3 高通量靶向测序

采用基因组DNA提取试剂盒抽提患者及家属的血样品进行检测，将离子通道病相关的73个致病基因做成一个心律失常基因合集，用于高通量靶向测序，测量其外显子区及其附近区域。

基因合集如下：AKAP9、CACNB2、GPD1L、KCNQ1、PKP2、SCN4A、SNTA1、ANK2、CACNB3、HCN4、LAMA4、PRKAG2、SCN4B、SYNE1、ABCC9、CALM1、KCNA5、KCND3、PSEN2、SCN5A、TAZ、CACNA1A、CALM2、KCNE1、MYH6、RBM20、SCN7A、TBX20、CACNA1B、CAV3、KCNE2、MYH7、RYR2、SCN8A、TCAP、CACNA1C、CRYAB、KCNE3、MYL3、SCN10A、SCN8A、TMEM43、CACNA1D、DMPK、KCNE4、MYLK2、SCN11A、SCN9A、TNNT2、CACNA2D1、DSP、KCNH2、MYOT、SCN1A、TRPM4、CACNA1E、FKRP、KCNJ2、MYPN、SCN1B、SDHA、CACNA1F、FKTN、KCNJ5、NOG1、SCN2A、SGCA、CACNA1G、FXN、KCNJ8、NPPA、SCN3B、SLMAP。

首先配置Barcode反应体系，纯化Barcode液及扩增库，纯化库，然后测定库溶液浓度并稀释。完成建库后，根据测序仪的要求制备IonPGMTM模板，用ES纯化OneTouch后的产物，然后上机测序并分析结果。

用高通量测序筛查出先证者血样中DNA突变，滤除UCSC数据库Common SNPs，滤除dbSNP数据库及1000-genome-project数据库的常见突变，滤除无功能的同义突变和内含子突变，筛选出候选致病突变基因。

1.4 构建突变质粒

采用吉凯基因公司GV146-EGFP-KCNH2质粒及空载对照质粒。在野生型质粒基础上，用点突变试剂盒构建点突变质粒。点突变构建引物：KCNH2-mut-G120T-F，5′-AACGAGGATTGGGCTGTCATCATGTTCATCCT-3′；KCNH2-mut-G120 T-R，5′-ACAGCCCAATCCTCGTTCTTCACGG-GCACCAC-3′。扩增并提取点突变质粒后进行Sanger测序，确定其突变成功。

1.5 Western blot检测

收集目的细胞后提取细胞蛋白，BCA法测蛋白浓度，绘制标准曲线计算蛋白浓度。在上样孔中加入相应体积的蛋白混合液(20 μg)，空白孔中加入蛋白Marker，先恒压60 V电泳，蛋白进入下层胶后调整至120 V，恒压维持直至目的蛋白充分分离。350 mA恒流转膜，持续1.5 h。将PVDF膜置于5%脱脂牛奶中封闭1 h。先后孵育相应一抗、二抗后，ECL曝光显影。

1.6 膜片钳实验

配置细胞内液、细胞外液，制作玻璃微电极使电极范围至3～5 MΩ。在荧光显微镜下选择大小合适、表面光滑无颗粒的带荧光细胞，在电极与细胞膜形成的高阻抗封接稳定后，短暂快速负压破膜，进入全细胞记录状态，调节补偿电容，通过稳态激活、稳态失活、失活再恢复这一程序记录。用Clampfit软件记录电流数值并进行分析，然后用Sigma Plot软件制图。

2 结果

2.1 获取1个LQTS家系相关临床资料

先证者为46岁女性，因“发生晕厥1次”收住我院心血管内科。患者晕厥发作时伴意识丧失约10 min，无大小便失禁，无抽搐。苏醒后自觉心前区不适，约1 h后缓解。外院动态心电图示：窦性心动过缓，频发室性期前收缩，部分成对出现伴短阵室性心动过速。无特殊既往史及家族史。家族成员中无晕厥或SCD病史。入院检查：血常规、氨基末端脑钠尿肽(NT-proBNP)、心肌生化标志物、血沉、粪常规、D-二聚体、甲状腺功能等均未见明显异常。超声心动图示：心脏各房室瓣膜结构未见明显异常。心电图(图1A)提示QT(QTc)间期延长达501 ms，T波振幅低有切迹。入院诊断：长QT综合征，尖端扭转型室速，心源性晕厥可能性大。治疗方案：拟植入双心室起搏埋藏式心律转复除颤器(implantable cardioverter defibrillator，ICD)。

进一步对该患者家系进行调查。采用1993年Schwartz等提出的家系研究评分系统进行评估：若评分大于等于4分，则诊断为LQTS；若评分为2～3分，则为可疑诊断；若评分小于2分则可排除LQTS。该家系中包括先证者共4位兄弟姐妹诊断为LQTS，父亲为疑似LQTS(图1B)。

A：先证者典型心电图表现，QTc间期延长达501 ms，T波振幅低有切迹；B：LQTS家系图谱，4位兄弟姐妹均诊断为LQTS，父亲为疑似LQTS(○、□分别代表家系中正常女性及男性；●、■分别代表家系中LQTS女性及男性；灰色代表可疑LQTS成员；表示先证者)图1 获取的一个LQTS家系相关资料Fig.1 Related data of an LQTS family

另外，我们对该患者家系进行了心电图检查，心电图显示先证者兄弟姐妹中的Ⅱ3、Ⅱ4、Ⅱ9这3例患者均出现了QT间期延长，其余家属心电图均正常。

2.2 高通量测序筛选可疑突变位点

对突变位点进行功能预测，做了相关保守性评估，在HGMD等数据库进行检索，最后通过Sanger测序验证确定该阳性突变。这个突变点为KCNH2基因编码蛋白上第358位核酸碱基，由鸟嘌呤(G)突变为胸腺嘧啶(T)，为杂合突变。

2.3 明确该先证者家系中基因突变情况

对先证者直系及旁系亲属血样进行测序验证，我们发现除了先证者为KCNH2基因c.358G>T杂合突变之外，先证者确诊为LQTS的兄弟中也有该杂合突变(图2)，家属Ⅱ3、Ⅱ4、Ⅱ9均出现KCNH2 c.358G>T位点杂合突变，Ⅰ1未查血样，其余家属该碱基位点均为野生型。

一代测序确认先证者及部分家属基因突变情况图2 亲属一代测序验证图Fig.2 Verification diagram of the first generation sequencing of relatives

2.4 构建KCNH2 c.358G>T突变质粒(KCNH2-G120W)

以GV146为载体的KCNH2过表达质粒为基础，设计点突变引物，构建点突变质粒。通过质粒测序，我们确定成功构建了KCNH2-G120W突变质粒。KCNH2 c.358G>T突变改变了KCNH2蛋白的结构域(图3)，从而可能影响了KCNH2的蛋白功能。

左：野生型KCNH2蛋白结构图(绿色箭头为野生型肽段)；右：KCNH2 c.358G>T突变蛋白结构图(红色箭头为突变后的肽段)图3 KCNH2-G120W突变质粒的构建Fig.3 Construction of KCNH2-G120W mutant plasmid

2.5 转染KCNH2-G120W突变质粒观察对全细胞膜电位的影响

将等量的带EGFP标签的空白对照质粒、KCNH2-WT质粒、KCNH2-G120W突变质粒转染进HEK293T细胞系中，待转染48 h后将细胞置于荧光显微镜下可见细胞转染效率均较高(图4A)。我们将不同组细胞提取总蛋白后进行蛋白质印迹实验，最后曝光结果显示质粒转染成功，KCNH2-WT质粒组和KCNH2-G120W突变质粒组KCNH2蛋白水平均过表达(图4B)。

A：荧光显微镜下可见转染了空白对照质粒(a)、KCNH2-WT质粒(b)及KCNH2-G120W突变质粒(c)的细胞中有明显荧光；B：Western blot显示在HEK293T中转染成功图4 KCNH2-G120W突变质粒转染成功Fig.4 Successful transfection of KCNH2-G120W mutant plasmid

KCNH2基因编码mRNA后翻译成电压门控K+通道Kv11.1的α-亚基通道蛋白。这些α-亚基通道蛋白在心肌细胞肌膜形成通道，传导IKr电流。IKr缺失可延迟心室肌细胞AP的复极而导致LQTS。因此，我们假设该突变可能会导致IKr电流减小或消失，引起心肌复极异常，从而引发LQT2。为了进一步证实该假设，我们用膜片钳技术将转染KCNH2-WT质粒组和KCNH2-G120W突变质粒组的HEK293T细胞进行全细胞膜电位检测，记录的实验结果见图5。由此发现，KCNH2-G120W突变质粒组的尾电流显著下降，表示突变体不能正常地运送至细胞膜表面，从而导致电流下降。

A：KCNH2-WT质粒组膜片钳实验结果；B：KCNH2-G120W突变质粒组膜片钳实验结果；C：KCNH2-G120W突变质粒组相比于KCNH2-WT组尾电流显著下降，与KCNH2-WT组比较，*P<0.05图5 转染KCNH2-G120W突变质粒对全细胞膜电位的影响Fig.5 Effect of transfection of KCNH2-G120W mutant plasmid on whole cell membrane potential

3 讨论

遗传性长QT综合征是由多个基因位点之一的有害突变引起的，主要与3种心脏离子通道基因突变有关，分别是：KCNQ1(LQT1)、KCNH2(LQT2)和SCN5A(LQT3)[4-5]，我国LQTS患者中以LQT2型最常见，其主要与KCNH2基因突变有关。KCNH2基因突变通过多种机制引起IKr通道功能障碍，延长心肌细胞动作电位时间，心电图因心室复极延迟而表现为QT(QTc)间期异常延长[2-3]。心室复极延迟增加了患者发生致命性尖端扭转性室性心动过速(torsades de pointes，TdP)、室颤等恶性心律失常的风险[6]，患者可反复发作晕厥,甚至发生心源性猝死。

迄今为止，已鉴定出约300个KCNH2基因突变点，突变类型包括错义突变、无义突变、剪接突变、移码突变、片段缺失等突变类型，LQT2突变类型是根据IKr降低的不同分子机制来进行分类的[7]，即与导致最大电流降低的突变基因有关。研究表明，KCNH2基因编码Kv11.1通道α亚基，该亚基是心肌细胞动作电位2期和3期IKr激活的基础，因而在心脏复极中起着重要作用。心室肌细胞复极时，IKr通道功能障碍可引起K+外流减慢，导致复极时间延长，心电图出现QT间期延长。Shimizu等[8]对213个先证者家庭中的858例LQTS2型患者进行基因检测，共发现162个不同的KCNH2基因突变。突变点主要分布在3个区域：N端(28.4%，n=46)、C端(30.9%，n=50)和跨膜结构域(40.7%，n=66)。

在本研究中，我们从临床LQTS患者中筛选出具有遗传突变的LQT2家系，找到了KCNH2 c.358G>T杂合子突变。由此初步假设，KCNH2 c.358G>T突变可能是导致家族性LQT2的关键因素之一。KCNH2基因c.358G>T杂合突变改变了KCNH2基因编码的α亚基蛋白结构。α亚基为电压门控K+通道的蛋白，主要在心肌细胞肌膜形成通道，传导IKr电流。KCNH2-G120W突变体影响了IKr功能，导致IKr电流减小或消失，引起心室肌细胞动作电位复极时间延长，从而导致心肌复极异常，心电图表现为QT间期延长。为了验证该假设，我们设计了KCNH2 c.358G>T突变质粒，验证突变成功后将该突变质粒转染进HEK293细胞系中，利用全细胞膜电位来检测突变后的细胞膜电位变化趋势。在膜电位检测中，发现KCNH2-G120W突变质粒组的尾电流与KCNH2-WT组相比显著下降，提示该突变体不能正常地运送K+至细胞膜表面，从而导致电流下降。但是KCNH2 c.358G>T突变究竟是影响了Kv11.1 a通道蛋白的某个结构区域还是影响蛋白空间构象而导致蛋白功能异常，后续研究还需要进一步深入探讨。

多数LQTS患者可通过多种途径来控制疾病进展，如应用β-肾上腺素能受体阻滞剂、生活方式干预、避免服用延长QT间期的药物、避免低钾和低镁血症及针对高危临床特征患者植入ICD[9-11]。但因离子通道突变点位置不同，编码类型不同，其危险分层及具体治疗方法也不相同。本研究为LQTS的发病机制提供了新的突变位点，也为临床家系筛查提供了新的思路和研究方向。对该突变详细机制的进一步研究可能会为LQTS的治疗提供新的方法和手段，但仍需要更多基础层面的研究和临床实践的检验。