LAM／ITGα6β1／FAK信号通路在大鼠萎缩腮腺再生过程中的表达及意义

于成龙 薛博元 杨勇 唐学敏 李建卫 刘郭琦 宋娇娇 左金华

前期研究已发现，导管结扎后再通，萎缩的腺体可再生并恢复形态与功能，但其再生的信号机制尚未明了［1］。细胞基底膜上的层粘连蛋白（laminin，LAM）可与其受体整合素 α6β1（integrinα6β1，ITGα6β1）相互作用，并通过胞内的信号传导中枢黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）将细胞外机械力信号传递到细胞内，进而调控细胞的迁移、粘附、凋亡等多种生物学行为［2－3］。本实验拟通过检测 LAM、ITGα6β1、FAK分子在大鼠萎缩腮腺再生过程中表达变化，初步探讨腮腺损伤后再生的内在机制，为治疗唾液腺萎缩性疾病的相关研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

LAMγ1、ITGα6、ITGβ1兔抗大鼠单抗（Abcam公司，英国）；FAK兔抗大鼠多抗（CST公司，美国）；SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德）；5X蛋白上样缓冲液（大连美仑）；SDS-PAGE凝胶配置剂（上海碧云天）；PCR试剂盒（湖南艾科瑞）。

1.2 动物实验

60只8周龄雌性Wistar大鼠随机分为实验组（54只）和对照组（6只）。实验组随机分为结扎组（A组）和再通组（B组）。结扎组对大鼠腮腺主导管进行结扎，结扎7 d后获取腮腺组织标记为A7组（n＝6）；再通组于导管结扎7 d后全部再通，根据再通后的观察时间不同（再通第1、3、5、7、10、14、21、28天）随机分为为 B1、B3、B5、B7、B10、B14、B21、B28组 8个亚组（n＝6）。对照组标记为N组。

1.3 切片制备与HE染色

固定后的组织进行脱水、透明、包埋、切片。依次置于二甲苯、梯度酒精中脱蜡至水。按照HE染色试剂盒要求进行操作，晾干，中性树胶封片后显微镜下观察其组织形态学改变。

1.4 免疫组织化学染色

切片以SABC法进行免疫组织化学染色（高压蒸汽法进行抗原热修复），严格控制显色反应时间。封片，同等光源条件镜下拍照，Image-Pro Plus6图像分析软件对每张图片进行平均光密度值分析。PBS替代一抗为空白对照。

1.5 Western blot检测

按蛋白试剂盒说明提取各样本的蛋白质，采用BCA法进行蛋白浓度测定。根据浓度配制等质量体系，煮样。40μg蛋白样品上样于预先配制好的PAGE凝胶上电泳（恒压80 V 50 min，恒压 100 V 50 min），电泳结束后，恒流250 mA条件下在冰上转膜2 h，牛奶摇床封闭5 h，一抗4℃过夜，二抗室温下摇床1 h，ChemiDoc XRS＋凝胶成像系统（Bio-Rad，美国）进行曝光，拍照，Image J软件分析数据。

1.6 实时荧光定量PCR

提取总RNA，测定RNA纯度及浓度（以A260／A280比值在1.8～2.0为可用）。按照Evo M-MLV试剂盒说明合成cDNA。在冰上配制25μL qPCR反 应 体系，每个样本作3个复孔。在荧光定量PCR仪（Bio-Rad，CFX96TM，美国）上机并设置反应条件：95℃30 s 1 cycle；95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40个循环。读取并保存结果，计算 2－△△Ct值。

1.7 统计学处理

所有数据应用统计软件SPSS 17.0进行处理，实验组、对照组之间差异的比较采用两独立样本t检验，实验组中不同时间位点取材的组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HE染色结果

正常腮腺组织腺小叶内可见腮腺腺泡细胞数量丰富，排列严密。结扎组腮腺腺泡细胞丧失，炎症细胞浸润，腺小叶结构紊乱。再通后腺泡细胞数量逐渐增多，腺泡之间间隙减小，导管周围炎症细胞减少。至B28组整个腺小叶组织形态与正常组无明显差异（图1）。

图1 大鼠腮腺萎缩、再生过程HE染色 （×400）Fig 1 HE staining of parotid gland during atrophy and regeneration in rats （×400）

2.2 免疫组化结果

LAM在正常腺体组织中强表达，定位于腺泡细胞的基底膜，线性围绕细胞表面（图 2A）。结扎后腺泡基底膜破坏，A7组可见LAM染色中断明显，折叠褶皱、形状不规则（图2B），再通后LAM在腺泡细胞周围的连续性逐渐恢复，基底膜逐渐完整（图2C～2E）。染色强度在结扎第7天增强，再通后减弱，至B5组到最低值后逐渐增强，于B14组达到峰值随后降低（P＜0.05）。

ITGα6、β1共定位于腺泡细胞、导管上皮细胞的细胞膜中，染色规则完整（图2F，2K）。导管结扎后整合素α6、β1在腺泡细胞基底部的染色逐渐中断，宽窄不一（图2G，2L），再通后连续性逐渐恢复，至再通B28组，染色模式均与正常腮腺相似（图2J，2O）。染色强度在再通后减弱，于第3天到达拐点后上升，随后整合素α6在再通第14天到达峰值后下降，β1以B10组表达量最高而后下调（P＜0.05），至B28组表达量与正常组无统计学意义。

FAK则强烈且弥漫性表达在腺泡细胞的胞质中，导管系统表达不明显。在结扎7 d后FAK表达强度有所降低，再通后逐渐增高（P＜0.05），至 B28组，FAK在腮腺组织染色与正常组无明显差异（图2P～2T）。

图2 腮腺组织免疫组织化学染色（×400）Fig 2 Immunohistochemistry of the parotid gland tissue （×400）

2.3 Western blot检测与实时荧光定量PCR结果

LAM、ITGα6、ITGβ1在该模型中的蛋白变化趋势与基因水平变化趋势基本一致，在导管结扎7 d组（A7），LAM、ITGα6、ITGβ1表达量较正常组有所升高，再通后出现减低趋势。LAM在再通后第5天（B5）达到最低值后升高，至B14组到达峰值后下调。整合素α6、β1在再通第3天（B3）达到最低值后上升，随后ITGα6以B14组到达峰值，ITGβ1以B10组达到最高值，又均逐渐下调，至B28组与正常组无显著差异。FAK在结扎后7天时表达量下调，再通后逐渐增高至28组比正常组无统计学意义（图3～4）。

图 4 LAM／ITGα6β1／FAK相关分子 mRNA表达变化Fig 4 The mRNA levels of LAM／ITGα6β1／FAK relative factors

3 讨 论

导管结扎后再通导管以及腺体内压力变化，最终引起了萎缩性腮腺组织再生。多项研究表明，层粘连蛋白、整合素、FAK均可参与传递机械力信号，使细胞对其微环境作出感知和反应，从而自适应地重塑组织的形态结构与功能。Di Russo等［4］认为血管内皮细胞基底膜上的层粘连蛋白是血管能够对管腔内力学改变作出反应的基础。Ma等［5］发现整合素 FAK-ERK／PI3K介导了机械刺激对原代髁突软骨细胞增殖活性和凋亡的重要作用。牵引力下会使间充质干细胞（MSCs）整合素受体的数量增加，并表现出更明显的分化倾向［6］，这种分化倾向是组织再生的基础。

本研究发现，在正常组织以及萎缩腮腺再通过程中，LAM与ITGα6β1始终共定位于腺泡细胞基底膜。在导管结扎后再通过程中，层粘连蛋白、整合素α6β1表达量变化趋势几乎同步。LAM与ITGα6β1在腺泡细胞表达的空间相关性以及表达量变化的同步性均表明，在导管结扎、释放过程中，跨膜蛋白整合素α6β1始终受基底膜上的配体层粘连蛋白调控，并起到信号传递的作用。

前期研究发现，导管结扎7 d即可引起腮腺严重萎缩，再通后腮腺组织再生；而结扎28 d后再通，腮腺很难再生［7］，因此本实验选择导管结扎至7 d后再通。导管结扎后再通，应力改变，层粘连蛋白、整合素α6β1随之反应性降低。随着压力进一步释放，腮腺再生活跃，层粘连蛋白、整合素α6β1表达增高，证实了层粘连蛋白、整合素α6β1的高表达能够促进腺体组织的增殖、分化与再生。LAM／ITGα6β1／FAK在腺体组织分化中作用现已被较多研究所发现，例如，Baek等［8］发现整合素α6β1在涎腺组织源性多能干细胞中高表达，并可作为其表面标志物，意味着唾液腺表达整合素α6β1细胞具有干细胞特性。另外，此期间整合素α6β1在导管基底膜的染色增厚，证实了导管系统可能在涎腺再生、发育过程中发挥干细胞作用［9－11］。在而FAK在导管结扎、腮腺萎缩过程中降低，再通后逐渐升高至正常水平，表明与FAK表达量始终与应力变化、腮腺活动保持紧密相关性。

本研究结果显示 LAM／ITGα6β1／FAK作为信号通路能够对导管结扎、再通产生的机械力变化作出反应，在导管结扎诱导腮腺萎缩以及再通诱导腺体再生修复的过程中发挥重要作用，具体的内在机制有待于进一步深入的研究。LAM／ITGα6β1／FAK通路可能为唾液腺萎缩性疾病的基因及再生治疗提供新的靶点。