骨化三醇通过NF-κB信号通路促进牙周膜成纤维细胞分化

石金双 刘金艳 肖树林 张江琳 李晨

750001，银川市口腔医院 1.牙周黏膜科，2.正畸科

人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament fibroblasts，hPDLCs）与牙周组织的再生、修复、重建关系密切，具有成骨分化特性，可用于牙周疾病治疗［1］。维生素D与牙周健康关系密切，而骨化三醇（VD3）是活性最强的维生素D形式，可诱导成骨细胞分化并抑制细胞增殖［2］，但具体机制尚不清楚。核转录因子-kappa B（NF-κB）的活化在破骨细胞性骨溶解的病理过程中起承上启下的作用，可诱导炎症因子分泌并致骨溶解，抑制 NF-κB的表达可抑制细胞增殖、促分化［3］，猜测 VD3可能通过调控 NF-κB影响 hPDLCs。本研究从牙周膜组织中分离hPDLCs，VD3干预后行NF-κB激活或抑制处理，探讨VD3影响hPDLCs的机制。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

VD3（CAS：19356-17-3，10 mg）、NF-κB通路抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（pyrrolidine dithiocarbamates，PDTC）（P8765，Sigma，美国）；NF-κB通路特异性激活剂肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factorα，TNF-α）（Fitzgerald-10R-1382，Ambion公司，美国）；碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒（TE0009，上海星科生物科技有限公司）；一抗角蛋白（Cytokeratin）、波形丝蛋白（Vimentin）、NF-κB p65、Lamin B1、二抗山羊抗兔（Abcam公司，英国）。7500实时荧光定量PCR（Realtime quantitative PCR，qRT-PCR）仪（ABI公司，美国）；GelDoc XR＋蛋白凝胶成像仪（Bio-Rad公司，美国）。

1.2 hPDLFs取材

取银川市口腔医院牙科青少年正畸拔除的前磨牙，刮取根部1／3处牙周膜组织。

1.3 hPDLFs鉴定

常规培养牙周膜组织，提取原代细胞，细胞爬片，免疫荧光法检测细胞角蛋白、波形丝蛋白表达。

1.4 VD3浓度确定

实验分为：对照组、对照＋2%DMSO组、VD3浓度（mol／L）分别为 10－14、10－12、10－10、10－8。第 0、1、3、5、7 d添加CCK-8试剂酶标仪检测450 nm处各孔细胞吸光度A值。

1.5 实验分组

实验分组：对照组、对照＋DMSO组、VD3组（10－8VD3）、VD3＋NF-κB抑制剂组（10－8VD3＋10μmol／L PDTC）、VD3＋NF-κB激活剂组（10－8VD3＋20 ng／mL TNF-α）。

1.6 CCK-8检测细胞增殖情况

1.4 处理各组细胞5 d酶标仪检测450 nm处各孔细胞A值。

1.7 ALP试剂盒检测ALP活性

收集细胞按照ALP检测试剂盒说明书，波长560 nm处检测吸光度，按照标准曲线计算ALP活性。

1.8 茜素红染色检测细胞矿化情况

细胞矿化诱导10 d，1%茜素红染色30 min，光学显微镜下拍照，Image Pro Plus6.0软件鉴定矿化结节A水平。

1.9 RT-qPCR检测细胞中ALP、Runt相关转录因子（RUNX2）、骨钙素（OCN）mRNA水平

细胞处理10 d，提取总RNA逆转录成cDNA，RT-qPCR仪对 ALP、RUNX2、OCN、内参 GAPDH进行扩增。引物序列如下，ALP上游引物（Forward primer，F）：5′-ACCATTCCCACGTCTTCACATTTG-3′、下游引物（Reverse primer，R）：5′-AGACATTCTCTCGTTCACCGCC-3′；RUNX2 F：5′-TCTGGCCTTCCACTCTCAGT-3′；R：5′-GACTGGCGGGGTGTAAGTAA-3′；OCN F：5′-ATGAGAGCCCTCACACTCCTCG-3′、R：5′-GTCAGCCAACTCGTCACAGTC-3′，GAPDH F：5′-GCACCGTCA AGGCTGAGAAC-3′、R：5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAG T-3′，8μL反应体系进行扩增。

1.10 Western blot检测细胞核中NF-κB p65蛋白表达

核蛋白提取试剂盒提取核蛋白，凝胶电泳分离蛋白质、PVDF转膜；5%脱脂奶粉室温封闭2 h；对应加入一抗NF-κB p65、内参Lamin B1，4℃孵育过夜；加入二抗山羊抗兔室温孵育1 h。DAB显色试剂盒避光显色，蛋白凝胶成像仪拍照，定量分析。

2 结 果

2.1 hPDLFs的鉴定

hPDLFs呈长梭形，透明度高，折射率强，细胞形态大小均匀。细胞角蛋白染色阴性、波形丝蛋白胞质区染色阳性（图1）。

图1 hPDLFs鉴定 （免疫荧光，×200）

2.2 不同浓度VD3处理检测细胞增殖情况

随着VD3浓度的升高、实验天数的变长，细胞A450降低，具体情况见表 1。10－8VD3差异最明显，因此10－8VD3做进一步研究。

表1 不同浓度VD3（mol／L）处理后各组细胞A450值比较（n＝6，±s）

表1 不同浓度VD3（mol／L）处理后各组细胞A450值比较（n＝6，±s）

组 别 0 d 1 d 3 d 5 d 7 d对照组 0.19±0.02 0.27±0.03 0.47±0.05 0.69±0.07 0.54±0.06对照＋DMSO组 0.18±0.02 0.28±0.03 0.48±0.06 0.70±0.08 0.55±0.05 10－14 VD3组 0.20±0.03 0.26±0.04 0.46±0.05 0.61±0.06 0.51±0.04 10－12 VD3组 0.19±0.02 0.29±0.03 0.43±0.04 0.54±0.05 0.47±0.05 10－10 VD3组 0.20±0.02 0.26±0.02 0.36±0.04 0.46±0.04 0.43±0.04 10－8 VD3组 0.17±0.02 0.21±0.02 0.31±0.05 0.38±0.04 0.36±0.04 F值 1.697 5.482 11.824 28.567 14.149 P值 0.166 0.001 0.000 0.000 0.000

2.3 5组细胞增殖情况

在VD3基础上添加NF-κB抑制剂细胞A450水平降低，添加NF-κB激活剂细胞A450水平升高（表2）。

2.4 5组细胞ALP活性情况

在VD3基础上添加NF-κB抑制剂细胞ALP活性升高，添加NF-κB激活剂细胞ALP活性降低（表2）。

表2 5组细胞培养5 d时CCK-8实验的A值、ALP含量、茜素红染色A值比较（n＝6，±s）

表2 5组细胞培养5 d时CCK-8实验的A值、ALP含量、茜素红染色A值比较（n＝6，±s）

注：①与对照组相比，P＜0.05；②与对照＋DMSO组相比，P＜0.05；③与VD3组相比，P＜0.05；④与VD3＋NF-κB抑制剂组相比，P＜0.05

组 别 CCK-8实验A450 ALP含量（U／g prog） 茜素红染色A450对照组 0.64±0.07 6.84±0.73 0.03±0.01对照＋DMSO组 0.65±0.06 6.89±0.81 0.03±0.01 VD3组 0.35±0.04①② 15.67±1.21①② 0.36±0.04①②VD3＋NF-κB抑制剂组 0.19±0.03①②③ 23.43±2.18①②③ 0.47±0.05①②③VD3＋NF-κB激活剂组 0.47±0.04①②③④ 10.64±1.17①②③④ 0.21±0.03①②③④F值 91.429 167.783 222.692 P值 0.000 0.000 0.000

2.5 5组细胞矿化情况

在VD3基础上添加NF-κB抑制剂细胞矿化增强，添加VD3＋NF-κB激活剂细胞矿化减轻（图 2）。

图2 5组细胞矿化检测 （茜素红染色，×200）

2.6 5组细胞中 ALP、RUNX2、OCN mRNA、细胞核中NF-κB p65蛋白水平

在VD3基础上添加NF-κB抑制剂细胞中ALP、RUNX2、OCN mRNA水平升高，细胞核中 NF-κB p65蛋白水平降低；添加 NF-κB激活剂组细胞中 ALP、RUNX2、OCN mRNA水平降低，细胞核中 NF-κB p65蛋白水平升高（图3、表3）。

表3 5组细胞中ALP、RUNX2、OCN mRNA和细胞核中NF-κB、p65蛋白水平比较 （n＝6）

图3 5组细胞核中NF-κB p65蛋白表达

3 讨 论

牙周炎会造成牙槽骨吸收，附着丧失、影响咀嚼功能［4］，牙周膜细胞在一定条件下能向成牙骨质细胞、成骨细胞分化，为牙周组织再生提供了可能。VD3作为维生素D的活性代谢产物，可促进成骨细胞合成，对细胞成骨形成具有直接作用［5］。本研究提取hPDLCs，探究VD3对细胞分化影响，VD3能够促进ALP活性和RUNX2、OCN mRNA水平表达，ALP可释放到细胞培养液中，参与细胞外基质矿化过程，是hPDLCs分化的重要指标［6］；RUNX2可促进成骨前体细胞、骨原细胞分化并促进成骨细胞成熟［7］；OCN与骨基质内烃磷灰石紧密连接，是成骨细胞和骨矿化的特殊标志物［8］。VD3可抑制细胞增殖，且促进成骨前体细胞、骨原细胞分化、促进骨非胶原蛋白的形成、促进细胞矿化，但其机制尚需进一步研究。在牙龈卟啉单胞菌感染的PDLCs中病原菌可刺激NF-κB的抑制分子IκB磷酸化，促进NF-κB入核，调控靶基因后激活炎症反应、抑制成骨分化［9］；在细胞增殖中，贝沙罗汀在C6胶质瘤细胞中的处理可以通过抑制NF-κB从而促进细胞凋亡、DNA损伤，抑制活性氧生成和总抗氧化剂水平，抑制细胞增殖［10］。本研究中在VD3的基础上添加NF-κB抑制剂后，hPDLCs中细胞增殖减弱、成骨分化因子ALP活性和mRNA，RUNX2、OCN mRNA水平进一步升高，矿化增强；提示VD3能够抑制NF-κB通路从而抑制hPDLCs增殖、促进成骨分化。

VD3可通过抑制NF-κB入核进而抑制hPDLCs细胞增殖、促进成骨分化，进而实现对牙周疾病的缓解作用。但VD3影响NF-κB入核的具体机制尚不清楚，是本文接下来研究重点。