环境内分泌干扰物对子宫内膜异位症影响的生物信息学分析

李楠 陈蕾 张琨

环境内分泌干扰物（environmental endocrine disrupting chemicals，EDCs）包括双酚类、邻苯二甲酸酯类、二恶英类等，广泛应用于洗涤剂、增塑剂、阻燃剂等生产中。大部分EDCs具有半衰期长和生物富集等特点，在体内改变DNA甲基化水平，并长期影响生殖和类固醇激素相关基因的表达水平，进而影响女性性腺发育的激素依赖途径。而作为雌激素依赖性的子宫内膜异位症（endometriosis，EMS）发病率呈逐年增加趋势，持久影响女性生育能力及生活质量。已知EMS发病受遗传、氧化应激、免疫、环境等多种因素影响，且大量研究提示EDCs可能在病因学上参与EMS的发生。但EDCs种类繁多，作用机制复杂，人类EMS和EDCs暴露之间因果关系的直接研究证据很难获得，导致EDCs对EMS发生的潜在机制仍无定论。随着生物信息学的发展，遗传多态性研究备受关注。笔者采用生物信息学分析挖掘EDCs暴露在EMS发生中的潜在作用靶点及相关通路，旨在寻找EDCs暴露对EMS的潜在影响，为继续探究复杂环境中EMS的病因、致病机制乃至防治提供参考。

1 资料和方法

1.1 基因筛选 在毒物基因组学数据库（comparative toxicogenomics database，CTD）（http://ctdbase.org/）中检索双酚A（bisphenol A，BPA）、四氯二苯并对二恶英（tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）、邻苯二甲酸二酯[di-（2-ethylhcxyl）phthalate，DEHP]，在疾病栏找到Endometriosis，确定在EMS发生中与各EDCs暴露相关的基因。

1.2 确定共同作用基因 在Venn图网络工具（bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）中输入CTD数据库检索到的上述3种EDCs在EMS中的调控基因，进而确定3者调控的公共基因。

1.3 基因生物信息学分析 将上述共同作用基因输入富集分析数据库（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID）（https://david.ncifcrf.gov/），对其进行基因功能注释（gene onotology,GO）分析[错误发现率（FDR）值＜0.01为差异有统计学意义]和京都基因与基因百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析（FDR 值＜0.05为差异有统计学意义）。

1.4 基因蛋白互作网络（protein-protein interaction networks，PPI）构建 将共同作用基因上传到STRING数据库（http://string-db.org/）进行 PPI建设，并用 Cytoscape3.8.0 软件（www.cytoscape.org/）将 PPI网络可视化，并利用插件Analyze Network计算连接度最高的6个基因作为关键基因。

2 结果

2.1 确定共同作用基因 在CTD数据库检索到BPA与EMS相关的基因158个，TCDD与EMS相关的基因155个，DEPH与EMS相关的基因 25个，3者调控EMS的公共基因共25个，见图1。

图1 环境内分泌干扰物作用的公共基因

2.2 EDCs公共作用基因的GO分析 上述25个基因中包含一个非人类基因，对剩下24个基因进行GO分析，这些公共作用基因主要富集于对遗传信息的调控，以及受体和信号的转导等功能，见图2。

图2 环境内分泌干扰物公共作用基因的功能注释分析

2.3 EDCs公共作用基因的KEGG分析 对24个公共基因的作用途径进行KEGG分析，这些公共作用基因主要富集于甲状腺激素信号通路、催乳素信号通路、卵巢类固醇合成、MAPK信号通路和雌激素信号通路。结果提示，EDCs确实发挥了内分泌干扰作用，干扰机体内分泌相关信号通路，见图3。

图3 环境内分泌干扰物公共作用基因的富集通路分析

2.4 EDCs公共作用基因的PPI分析 最后筛选出原癌基因（fos proto-oncogene,FOS）、糖皮质激素受体（nuclear receptor subfamily 3 group C member 1，NR3C1）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、雌激素受体 β（estrogen receptor beta，ESR2）、类固醇受体共激活剂（nuclear receptor coactivator 1，NCOA1）、前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2）6 种在该网络中连接度最强的基因。

3 讨论

EMS是女性月经来潮后所发生的一种子宫内膜异位到其他部位的疾病。有研究发现，一些成人疾病可能起源于胎儿，即母体压力、污染物暴露等因素会影响胎儿基因编码，导致胎儿器官结构、新陈代谢和表观遗传等发生改变，增加患病风险[1]。EMS是一种雌激素依赖性疾病，雌激素对靶细胞的活性可能通过雌激素受体来实现。FOS被认为是雌激素早期反应的关键基因。一项研究发现，FOS基因在EMS中显著差异表达[2]，其一方面可通过调控基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达参与17β-雌二醇促进的人子宫内膜基质细胞侵袭，另一方面也可能通过诱导雌激素发挥作用，参与EMS的发生、发展。通过对狒狒EMS模型疾病进展中异位子宫内膜的基因表达变化分析发现，FOS是在对照组和6～7个月疾病模型之间存在差异调节的单个基因，且其参与的EGF信号通路和ERK/MAPK信号通路被显著调节[3]。NR3C1基因编码糖皮质激素受体，参与炎症性疾病的病理生理学。已经有研究发现EMS患者血清中皮质醇水平降低，甚至会影响EMS患者受孕[4]。但其在EMS发展过程中的具体作用还不清楚。EGFR编码表皮生长因子受体，在EMS患者的异位病灶、血液、腹腔液中水平明显增高，促进EMS侵袭，转移过程中的血管生成。未来靶向VEGF基因治疗EMS将会是重要方向。ESR2基因编码ERβ，ERβ是EMS症患者的主要雌激素受体。多项研究均已证实ESR2基因多态性会增加患EMS的风险[5]，且异位子宫内膜组织ESR2基因表达水平则明显高于正常子宫内膜，ESR2 mRNA水平表达与其甲基化程度相关[6-7]。NCOA1是一种类固醇受体共激活剂，在人类和小鼠异位内膜病变中有选择性地高水平表达，在子宫生物学和病理生物学中起着关键作用，没有NCOA1小鼠子宫内膜无法表现出完整的蜕膜反应。有研究提示，TNF-α-MMP-9-NCOA1异构体信号轴通过阻止TNF-α介导的人类EMS细胞的凋亡来促进EMS的发病进展[8]。有研究提示NCOA1是雌激素的主要辅激活子后，调控异位内膜基质细胞表达基质细胞衍生因子1[9]。而基质细胞衍生因子1是内皮细胞、淋巴细胞和造血祖细胞的增殖和趋化因子，在组织修复、血管生成、侵袭和迁移中发挥重要作用。PTGS2编码前列腺素内过氧化物合酶2，又名环氧合酶2，在各种细胞中可以被炎症因子，有丝分裂原及生长因子诱导，参与炎症反应，细胞增殖和凋亡。在EMS患者异位病灶和腹腔液中，PTGS2水平异常升高[10]，且PTGS2抑制剂可以促进EMS子宫内膜细胞凋亡[11]，提示PTGS2将来有望成为EMS的治疗靶点。

总之，上述分析可以预测EDCs在EMS中的作用机制与其内分泌干扰性质相关，能够作用于一些基因干扰内分泌信号通路，影响类固醇激素信号转导，可能在EMS发生、发展中起重要作用。EMS是女性生殖系统良性疾病，可能会恶变为卵巢透明细胞癌和子宫内膜癌，如何早期诊断EMS并提前干预、改善预后仍然是临床难题。近年针对基因水平改变的研究逐渐增多,在妇科肿瘤进展中表观遗传学机制已成为一个重要影响因素。随着检测技术的进步，一些表观遗传现象如DNA甲基化、微小RNA的表达和基因沉默、染色质重塑等改变在EMS中被鉴定出来,有望成为EMS新的预测生物标志物和治疗靶点。而通过进一步挖掘环境-基因作用对EMS发病的影响及未来对EMS表观遗传学研究的深入，可能会找到新的靶点并为EMS的预防及早期诊断和靶向治疗提供新的思路。