过继回输耐受性树突状细胞促进大鼠肝移植免疫耐受的应用研究

贾亚男 周林 赵阳 汪京 陈晴 王若麟 郎韧 贺强 李先亮

耐受性树突状细胞（tolerogenic dendritic cell，tolDC）因其强大的负向免疫调节特性，是诱导免疫耐受最有潜力的工具细胞[1-2]。多项研究提示，回输细胞因子等诱导的tolDC可以延长移植肝、肾的存活时间，但是并未达到耐受的理想状态[3-4]，提示研究tolDC在免疫耐受中的作用机制具有重要的临床意义。

目前认为，具有诱导免疫耐受特性的tolDC主要包括低表达共刺激分子与主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC） Ⅱ 分 子的髓样树突状细胞（myeloid dendritic cell，mDC）和浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cell，pDC）两类[5]。我们前期研究发现pDC在移植免疫耐受中发挥着重要作用[6]，然而在免疫耐受诱导中是否同时存在mDC、pDC的变化，二者是否具有协同作用，至今尚不清楚。本研究拟在前期研究的基础上，在耐受与急性排斥反应（acute rejection，AR）模型、tolDC回输的AR模型中探明二者的免疫调节特性，为诱导免疫耐受提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级Brown Norway（BN）大鼠36只与Lewis大鼠18只（包括建立移植模型及细胞提取），体质量200～230 g，均购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证：SCXK-（京）2016-0006。本研究经首都医科大学伦理委员会批准，实验过程中对大鼠的处置按照中华人民共和国科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》相关规定进行，符合实验动物伦理学管理要求。

1.2 实验试剂

重组大鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（20 ng/μL），重组大鼠白细胞介素 4（recombinant rat interleukin-4，rrIL-4）（10 ng/μL），抗藻红蛋白（phycoerythrin，PE）微珠，荧光素标记的单克隆抗体PE-CD11c、PE-CD11b、别藻蓝蛋白（allophycocyanin，APC）-MHCⅡ和异硫氰酸苯酯（phenylisothiocyanate，PITC）-CD86均购于美国BD公司。 Lysing buffer购自美国Thermo公司，酶联免疫吸附试验（enzymelinked immune absorbent assay，ELISA）试剂盒购于美国BD公司。

1.3 细胞制备

取出18只BN大鼠双侧带双关节股骨后置于超净台，用无菌组织剪剪断两端骨质，暴露骨髓腔，用5 mL注射器吸取适量磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）重复多次冲洗骨髓腔，直至骨髓腔发白。足量收集组织细胞冲洗液，1000×g离心 15 min，弃上清，用RPMI1640培养液轻柔重悬细胞并调整细胞数为 2×106/L，接种于 6 孔板中，加入重组大鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、rrIL-4，隔日计数细胞并半量换液，适时对相关因子进行补充，至第7日足量收集悬浮细胞，1000×g离心并重悬后进行磁珠CD11b/c分选、流式细胞术鉴定，阳性率>95%的细胞样本用于回输。

1.4 模型建立与标本收集

根据既往研究报道，以BN大鼠肝脏为供肝，Lewis大鼠为受体的肝移植模型可以自发产生免疫耐受；而以Lewis大鼠肝脏为供肝，BN大鼠为受体的肝移植模型会发生明显的AR[7]。本研究采用“双袖套法”建立BN→Lewis的大鼠肝移植自发耐受模型（耐受组，n=6）和Lewis→BN的大鼠肝移植AR模型，AR模型大鼠中实验组进行tolDC治疗性回输（tolDC组，n=6），对照组无干预措施（AR组，n=6）。tolDC组术前7 d、术后7 d和28 d分别经尾静脉注射从大鼠骨髓组织中分离出的tolDC悬液500 μL（含1×106个细胞），tolDC组受体大鼠死亡后立即采集足量外周血样本和组织标本，术后7 d采集AR组受体大鼠外周血样本和组织标本，术后100 d采集耐受组受体大鼠外周血样本和组织标本，分别用于tolDC亚群分析以及组织病理学分析。

1.5 检测方法

1.5.1 肝组织病理学检查提取各组大鼠约0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm大小肝组织，甲醛固定、脱水、包埋，切片后进行苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，光学显微镜下观察组织细胞一般形态并采集图像。

1.5.2 大鼠外周血tolDC流式分析分别取100 μL外周血，依次加入抗体PE-CD11c、PE-CD11b、APCMHCⅡ、FITC-CD86检测mDC与pDC，加入相应的抗体后震荡混匀，室温25 ℃暗室孵育15 min，加入1×Lysing buffer继续孵育15 min，加入PBS，180×g离心6 min，弃上清，采用流式细胞仪进行检测。

1.5.3 移植肝、脾脏、淋巴结tolDC流式分析将移植肝、脾脏、腹腔淋巴结组织分别置于超净台充分研磨，以200目筛网过滤，以Ficoll法4 ℃、180×g离心35 min，提取单个核细胞，加入PBS充分吹打混匀，25 ℃、180×g离心6 min，弃上清，加入PBS，分别提取100 μL细胞悬液进行检测，免疫抗体染色同外周血，恒温孵育结束后，加入PBS，180×g离心6 min，弃上清，采用流式细胞仪进行检测。

1.5.4 ELISA检测白细胞介素-10与干扰素-γ利用ELISA法检测各组细胞悬液白细胞介素（interleukin，IL）-10以及干扰素（interferon，IFN）-γ的表达情况，具体方法步骤参照美国BD公司ELISA试剂盒说明书。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，各组均数间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠术后生存时间和移植肝病理学表现

以Lewis大鼠肝脏为供肝，BN大鼠为受体的AR组大鼠肝移植术后产生明显的AR，生存时间7～14 d，组织病理学表现主要为炎症细胞浸润和组织结构紊乱（图1A）；以BN大鼠肝脏为供肝，Lewis大鼠为受体的耐受组大鼠75%以上均可以产生自发性耐受，生存时间均超过100 d（图1B）；而过继输注tolDC后可以延长AR大鼠的生存时间，最短生存时间45 d，中位生存时间67 d，最长生存时间102 d，移植肝的组织形态基本接近耐受大鼠，仅在汇管区有淋巴细胞浸润（图1C）。

2.2 各组大鼠外周血、移植肝、脾脏、淋巴结mDC表达情况

与AR组比较，耐受组和tolDC组大鼠外周血、移植肝、脾脏、淋巴结中CD11+mDC水平均下降（均为P<0.05）；与耐受组比较，tolDC组大鼠外周血、移植肝、脾脏、淋巴结中CD11+mDC水平差异均无统计学意义（均为P>0.05，图2）。进一步分析发现，与AR组比较，耐受组和tolDC组大鼠mDC表面共刺激分子CD86、MHCⅡ表达水平均降低（均为P<0.05，图3）。

2.3 各组大鼠外周血、移植肝、脾脏、淋巴结pDC表达情况

与AR组比较，耐受组和tolDC组大鼠外周血、移植肝、脾脏、淋巴结中pDC的水平均升高，差异均有统计学意义（均为P<0.05，图4A）；与AR组比较，耐受组和tolDC组大鼠外周血、移植肝、脾脏、淋巴结中pDC表面MHCⅡ表达水平均降低（均为P<0.05，图4B）。

2.4 各组大鼠血清IL-10和IFN-γ表达情况

与AR组的血清IL-10表达水平[（2.3±0.6）pg/mL]比较， 耐受组 [（8.4±1.3）pg/mL]和 tolDC组[（6.8±1.6）pg/mL]大鼠血清 IL-10的表达水平均升高（均为P<0.05）；与AR组的IFN-γ表达水平[（16.1±2.9）pg/mL]比较，耐受组[（7.5±0.9）pg/mL]和 tolDC 组 [（8.0±1.2）pg/mL]大鼠血清IFN-γ的表达水平均降低（均为P<0.05）。

3 讨 论

尽管免疫抑制剂的使用为肝移植受者的长期生存提供了可能，但是免疫抑制剂所带来的诸如术后感染、肿瘤复发等问题也不容忽视[8]，因此，找到一种可行的方式抑制肝移植术后AR是临床中亟待解决的问题之一。树突状细胞主要包括mDC与pDC两大类，除了抗原提呈功能外[9-11]，多数研究表明tolDC能够通过表达低水平MHCⅡ类分子诱导T细胞无能或凋亡及促进调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）分化发育从而抑制免疫反应发生[12-14]，但是pDC和mDC在肝移植免疫耐受中的共同作用及两者之间的相互比较相关研究较少。随着细胞治疗在免疫领域的发展，通过过继回输树突状细胞等方式对肝移植术后AR进行干预，有望彻底解决肝移植术后移植物长期生存的问题[15-16]。

笔者前期研究发现，pDC、tolDC都有可能通过诱导CD8+CD45RClowTreg介导大鼠肝移植免疫耐受[17-18]，但是，在免疫耐受发生中是否同时存在pDC与mDC的变化与相互作用需要进一步探讨。在本研究中，利用诱导分化骨髓来源tolDC回输干预能够明显延长肝移植术后大鼠生存期，达到免疫耐受的状态，其移植肝组织病理学表现与自发耐受大鼠无明显差异。利用该tolDC回输大鼠与自发耐受大鼠体内的变化作为分析的标准，并以AR大鼠作为对照，发现不管是人为诱导发生耐受还是自发性耐受大鼠，mDC的表达均处于较低水平，同时低表达MHCⅡ与CD86，而CD86在成熟树突状细胞表面大量表达[19]。CD11参与细胞的识别、活化和信号传导，故在细胞活化时分泌增多[20-21]。mDC表面的CD86是T细胞表面CD28与细胞毒T淋巴细胞相关抗原4的配体，CD86与CD28的亲和力改变，使得该通路的信号转导诱导T细胞激活，降低CD86的表达有助于T细胞的无能，促进耐受的发生[22-24]，本研究与既往文献报道一致。

本研究还发现tolDC回输大鼠、耐受大鼠的pDC表达水平升高，这与笔者前期研究结果一致，同时其表面低表达MHCⅡ类分子。在体外，人pDC诱导T细胞分化为产生IL-10的Treg[25-27]，辅助性T细胞（helper T cell，Th）1/Th2的偏移有助于免疫耐受的发生[28]。在本研究中，tolDC回输大鼠与耐受大鼠IL-10的表达水平均升高，通过直接或间接方式促进T细胞分化成熟，从而导致增强免疫应答的表面因子IFN-γ水平降低[29]。这些均提示在免疫耐受的过程中低表达共刺激分子的mDC和pDC共同发挥作用。

在本研究中，回输tolDC大鼠外周血、移植肝、脾脏、淋巴结的mDC和pDC的变化与自发耐受大鼠的变化一致，进一步提示低表达共刺激分子的mDC和pDC在免疫耐受中均发挥促进效应。pDC可能主要通过诱导分泌IL-10的Treg发挥作用，而低表达共刺激分子的mDC主要通过诱导Treg生成和诱导T细胞无能发挥作用，但是本研究仅为现象层面的观察，二者之间的相互作用机制仍需要进一步探讨。

综上所述，作为tolDC亚群，pDC和mDC在肝移植术后移植物免疫耐受发生过程中均发挥着正向调节作用。