复方扶芳藤合剂含药血清促进骨髓间充质干细胞增殖的作用机制

吴玲玲 陈继冰 蒋鹏 解百宜 李万里 杨玉伟 武桢 丰丙政 高宏君

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）是一种具有自我更新和多向分化潜能的干细胞[1]，在特定的微环境和适宜的细胞因子作用下可转化为胰岛β样细胞，促进胰腺再生[2]，是糖尿病替代疗法的热点，但昂贵的干细胞动员剂阻碍了该技术的临床应用。积极寻求新的干细胞动员剂对于BMSC替代疗法的应用具有重要意义。

在调控干细胞增殖、分化的生物学过程中，Notch信号通路起到了关键作用[3]。Notch信号通路与干细胞的自我更新、细胞增殖及细胞凋亡等密切相关[4]，它是构成干细胞信号网络的重要途径之一，Delta样 配 体（delta-like ligand，DLL）1、DLL3、DLL4、JAG1、JAG2为典型的Notch配体，可结合Notch1、Notch2、Notch3 或 Notch4 受体[5]。Notch 信号经过受体与配体激活后引发一系列水解反应，释放Notch1胞内段结构域（Notch1 intracellular domain，NICD）与DNA结合蛋白CSL结合，进而激活下游因子Hey1的表达，NICD主要在Notch1受体进入细胞核后发挥重要作用，当通过核孔进入细胞核后，与转录调控因子CBF1结合启动Hey下游基因转录[6]，进而促进细胞增殖、细胞分化[7]。Notch1作为Notch信号通路中的主要受体，与其配体DLL1及下游靶基因Hey1是调控细胞分化的关键信号通路之一[8]。

许多中药被发现能通过激活Notch信号通路促进大鼠BMSC的增殖及分化[9-11]，也能增强BMSC的归巢作用。复方扶芳藤合剂能益气补血、健脾养心，有研究发现其能促进大鼠BMSC的增殖[12-13]，说明其有成为干细胞动员剂的可能。张颖等[14]研究发现，10%的复方扶芳藤合剂含药血清可以使大鼠BMSC Notch1 信号通路上的关键基因和蛋白表达上调。本研究使用复方扶芳藤合剂含药血清对大鼠BMSC进行体外干预，通过抑制Notch1信号通路，初步探讨其对大鼠BMSC增殖的影响和可能机制，为下一步使用中药动员BMSC提供理论基础。本研究采用小干扰核糖核酸（small interfering RNA，siRNA）法沉默Notch1信号通路，能更准确地观察复方扶芳藤合剂含药血清对目标基因的作用，且具有安全性及效率性更高的优点。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

健康雄性4周龄SD大鼠10只，体质量（100±10）g，健康雄性SD大鼠20只，体质量（180±20）g，均购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。本实验通过广西中医药大学动物伦理委员会批准。

复方扶芳藤合剂由广西中医药大学制药厂提供（国药准字Z45021781，规格15 mL），其有效成分为扶芳藤、黄芪、红参。高糖Dulbecco改良的Eagle培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）、胎牛血清、青-链霉素双抗混合液购自美国Gibco公司，四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）试剂盒购自美国Sigma公司，Trizol试剂购自美国Thermo Fisher公司，逆转录试剂盒购自莫纳（武汉）生物科技有限公司，含0.25%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）和不含EDTA的胰酶均购自北京Solarbio公司，β-actin、DLL1、Hey1一抗及二抗购自江苏Affinit公司，藻红蛋白（phycoerythrin，PE）标记的抗大鼠CD45蛋白抗体、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的抗大鼠CD44蛋白抗体、别藻蓝蛋白（allophycocyanin，APC）标记的抗大鼠CD90蛋白抗体购自北京达科为生物技术有限公司，siRNA购自上海吉玛公司，Lipofectamine 2000 购自美国Thermo Fisher公司。

1.2 细胞培养与分组

用0.3 mL/100 g的2%戊巴比妥麻醉10只SD大鼠[体质量（100±10）g]，无菌条件下快速去除肌肉等软组织，取出股骨和胫骨，剔净，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）浸泡清洗2次。剪开骨端，用无菌注射器吸取含10%胎牛血清的DMEM完全培养基反复冲洗骨髓腔，直至骨质发白。将冲出的骨髓内容物制成单细胞悬液，取上清，200×g离心5 min后去上清，加入适量完全培养基，重悬细胞，接种后置于37 ℃，5% CO2的培养箱中原代培养。

将第3代BMSC分为空白对照组、含药血清组、Notch1 siRNA组和Notch1 siRNA+含药血清组。空白对照组BMSC进行常规培养；含药血清组BMSC采用1.56%复方扶芳藤合剂含药血清培养（预实验采用MTT法确定的最佳浓度）；Notch1 siRNA组BMSC采用siRNA敲降Notch1基因后更换新鲜培养基培养；Notch1 siRNA+含药血清组BMSC采用siRNA敲降Notch1基因后，用1.56%复方扶芳藤合剂含药血清培养。

1.3 实验方法

1.3.1 复方扶芳藤合剂含药血清制备取20只健康雄性SD大鼠[体质量（180±20）g]，适应性饲养1周。复方扶芳藤合剂每日3 mL/kg分两次灌胃，连续14 d，采血前禁食12 h，末次灌胃后1 h，无菌条件下腹主动脉取血，37 ℃静置1 h，200×g离心15 min，取上清液，0.22 μm滤膜过滤除菌，56 ℃恒温水浴锅中放置30 min，-20 ℃保存备用[15-16]。

1.3.2 BMSC表面标志物的表达鉴定取第3代BMSC，去除旧培养基，PBS冲洗后，加入不含EDTA的胰酶消化，200×g离心5 min，去上清，PBS重悬细胞，分装至4个1.5 mL的离心管中，分别加入 FITC荧光标记的CD44抗体、PE标记的CD45抗体和APC标记的CD90抗体各25 μL，对照组加PBS，混匀后4 ℃避光孵育30 min，200×g离心3 min，PBS洗涤2～3次，采用流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达。

1.3.3 siRNA法沉默Notch1信号通路将处于对数生长期的第3代BMSC按照5×105/孔接种至6孔板上，在5% CO2、37 ℃环境下常规培养，待细胞融合度达到60%～70%时，根据转染试剂Lipofectamine 2000说明书进行瞬时转染，分为siRNA阴性对照（siRNA-negative control，siRNA-NC） 组 和 Notch1 siRNA组。转染6 h后，更换新鲜培养基继续培养，培养至24 h后，收集各组细胞进行后续实验。

1.3.4 MTT法检测细胞增殖每孔2000个细胞接种至96孔板，每组设6个复孔，其中空白对照组及Notch1 siRNA组加入正常培养基，含药血清组及Notch1 siRNA+含药血清组加入含1.56%复方扶芳藤合剂含药血清的培养基继续培养24 h，MTT法检测细胞增殖。

1.3.5 实时荧光定量聚合酶链反应检测Notch1信号通路相关信使核糖核酸的表达将第3代BMSC接种于6孔板，各组培养24 h后，加入含0.25%EDTA的胰酶消化，提取总RNA，逆转录为互补脱氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA），以三步法对 cDNA进行扩增，计算各组 2-ΔΔCT，即得各组目的基因信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）表达与对照组mRNA 的倍数。

1.3.6 蛋白质印迹法检测Notch1信号通路相关蛋白的表达将第3代细胞接种于 6孔板，各组培养24 h后，提取总蛋白，经电泳分离后，将待测蛋白转移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，封闭1 h后加入稀释的β-actin、DLL1、Hey1一抗，4 ℃过夜。洗膜3次后，加入二抗，室温孵育1 h。洗膜3次后，于暗室曝光。用ImageJ软件对条带的灰度值进行测定，用相对定量进行分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 BMSC的形态学观察

用倒置显微镜对分离的BMSC进行观察，当培养24 h后，部分细胞贴壁分散生长，外形呈椭圆并具有明显的透光性。培养48 h后，出现多个细胞集落，呈放射状，伸出长短不一、粗细不均的突起，未出现融合生长，单个细胞形态呈梭形（图1A）。继续培养至96 h，细胞集落面积不断增大，且与周边集落逐渐融合生长（图1B）。继续培养至144 h，出现梭形细胞，且细胞布满整个视野（图1C）。传至第1代，细胞钝化，形态较为单一，呈长梭形贴壁生长，以平行排列生长为主或呈漩涡状生长（图1D）。

2.2 BMSC表面标志物的表达鉴定

流式细胞仪检测结果显示，培养的第3代BMSC阳性表达CD90、CD44，阳性率分别为98.22%、86.95%，而CD45呈阴性表达，阳性率为9.90%。提示已成功分离培养BMSC，可用于下一步实验研究（图2）。

2.3 Notch1 siRNA敲降结果鉴定

实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction， RT-qPCR）结果显示，与siRNA-NC组比较，Notch1 siRNA组Notch1 mRNA相对表达量下降，差异有统计学意义（1.00比0.23，P<0.05）。表明Notch1 siRNA能抑制BMSC中Notch1 mRNA的表达。

2.4 含药血清对大鼠BMSC增殖的影响

MTT结果显示（图3），与空白对照组比较，含药血清组和Notch1 siRNA+含药血清组BMSC的增殖率均升高，Notch1 siRNA组BMSC的增殖率下降（均为P<0.05）；与Notch1 siRNA组比较，Notch1 siRNA+含药血清组BMSC的增殖率升高（P<0.05）。表明复方扶芳藤合剂含药血清可增加BMSC的增殖率。

2.5 Notch1信号通路相关mRNA的表达

RT-qPCR结果显示（图4），与空白对照组比较，含药血清组Hey1、DLL1的mRNA相对表达量均升高，Notch1 siRNA组和Notch1 siRNA+含药血清组Hey1、DLL1的mRNA相对表达量均下降，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；与Notch1 siRNA组比较，Notch1 siRNA+含药血清组Hey1、DLL1的mRNA相对表达量均升高，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。

2.6 Notch1信号通路相关蛋白的表达

蛋白质印迹法检测结果显示（图5），与空白对照组比较，含药血清组Hey1、DLL1的蛋白相对表达量均升高，Notch1 siRNA组和Notch1 siRNA+含药血清组Hey1、DLL1的蛋白相对表达量均下降，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；与Notch1 siRNA组比较，Notch1 siRNA+含药血清组Hey1、DLL1的蛋白相对表达量均升高，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。

3 讨 论

糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病。国际糖尿病联盟推测到2040年世界糖尿病人口数将达到6.42亿[17-18]。当前，糖尿病的治疗方法主要以药物治疗为主，可暂时性缓解高血糖症状，但不能彻底治愈糖尿病，无法从本质上阻止各种并发症的发生[19]。胰岛β细胞功能不全是糖尿病的一个共同特征，所以找到有替代功能的胰岛β细胞是治疗糖尿病的有效疗法[20]。目前，越来越多的科学家将干细胞作为胰岛β细胞的来源[21]。

BMSC是骨髓组织中不仅能分化为属于同一中胚层谱系的骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，又有跨系和跨胚层分化的能力[22]，具有免疫原性低、培养周期短、易于扩增和保存等特点。BMSC具有多种免疫调节功能，包括抑制效应T细胞功能和树突状细胞的分化，以及激活T细胞功能，并可促进血管生成和抑制炎症反应。李艳华等[23]在体外将人类BMSC成功诱导分化为胰岛样细胞团，经过RT-qPCR检测，该胰岛样细胞团可表达胰岛素启动子因子-1、胰岛素和神经元素3。Couri等[24]研究人员将自体BMSC移植于1型糖尿病患者体内，发现移植后患者胰岛β细胞的保护功能明显改善。由此可知，无论是在体外将BMSC诱导为胰岛β细胞后移植，还是直接将BMSC移植于1型糖尿病患者体内，都能起到相关治疗作用，如何快速获得大量BMSC是干细胞疗法的关键决定因素之一，而其增殖速度与细胞动员剂密切相关。目前常用的干细胞动员剂如重组粒细胞集落刺激因子，其所需的动员时间长、剂量大、费用高，一般患者难以承受[25]。研究发现，多种补益类中药如当归、人参、黄芪等单味中药具有动员干细胞的作用[26-27]。复方扶芳藤合剂由扶芳藤、黄芪、红参3味中药经提取、精制而成[28]，具有益气补血、健脾养心之功效[29]。有研究表明，复方扶芳藤合剂能促进大鼠BMSC的增殖[12-13]，有作为干细胞动员剂的可能，且该中药具有不良反应小、价格便宜等优点。

本研究通过直接贴壁法体外分离、培养、纯化BMSC，对其进行细胞形态学观察，发现培养24 h后，部分BMSC即可贴壁分散生长，细胞状态良好，以梭形为主，通过换液、传代可以获得纯度较高且具有贴壁活性的BMSC。采用流式细胞仪对大鼠BMSC进行表型鉴定，结果显示，大鼠BMSC相对特异性抗原CD44 的阳性表达率为86.95%，CD90的阳性表达率为98.22%，而几乎不表达造血细胞表面抗原CD45。MTT结果显示，复方扶芳藤合剂含药血清可以显著增加BMSC的增殖率，使用siRNA沉默Notch1后可显著降低BMSC的增殖率，沉默Notch1后再加入复方扶芳藤合剂含药血清可以逆转这种作用，显著增加BMSC的增殖率，表明复方扶芳藤合剂含药血清可促进BMSC的增殖。进一步研究发现，使用复方扶芳藤合剂含药血清干预BMSC后，可激活Notch1信号通路，表现为Notch1信号通路的主要效应蛋白Hey1、DLL1的mRNA和蛋白表达增多。使用siRNA沉默Notch1信号通路后，Hey1、DLL1的mRNA和蛋白表达水平均降低，而使用复方扶芳藤合剂含药血清干预沉默Notch1信号后的细胞，其Hey1、DLL1的mRNA和蛋白表达水平均升高，表明复方扶芳藤合剂含药血清可能通过调控Notch1信号通路相关蛋白表达促进BMSC的增殖。

综上所述，复方扶芳藤合剂含药血清可促进大鼠BMSC的增殖，其作用机制可能与Notch1信号通路激活有关。