超高效液相色谱法快速测定饮料中赤藓红含量

谢 赛

(北京市东城区疾病预防控制中心，北京 100009)

为使食品保持或增加色泽，增进食欲，吸引消费者目光，生产厂家往往向食品中添加一些天然色素或合成色素。合成色素是以苯、甲苯、萘等化工产品为原料，经过磺化、硝化、卤化、偶氮化等有机反应制成[1]。合成色素具有价格低廉、稳定性好、不易褪色等优点，被广泛应用于食品加工行业中，但合成色素有一定毒性，过多食用会危害人体健康，甚至产生致癌性和致突变性等危害[2]。

赤藓红(Erythrosine，E127)呈红色或红褐色，为非偶氮类人工合成着色剂，相较于大多数偶氮类合成色素，其具有化学结构和性质上的差异[3]。国际食品法典委员会(CAC)、欧盟、美国、中国、日本和韩国等都允许在饮料中使用赤藓红[4]。其检测方法有液相色谱法[5]、表面增强拉曼光谱法[6]、免疫PCR法[7]、示波极谱法[8]等，其中有关高效液相色谱法(HPLC)测定赤藓红的研究较多[9-12]，但是样品的检测时间较长，除去前处理时间，每件样品上机测定时间约需30 min，且有机试剂消耗量较大。表面增强拉曼光谱法适用于现场快速检测但检出限较高，免疫PCR法的回收率范围较宽，示波极谱法为早期研究方法但目前研究较少。超高效液相色谱(UPLC)是传统高效液相色谱技术的升级和提高，与传统的高效液相色谱相比具有分离度好、检测速度快和灵敏度高等优点，可以有效缩减检测时间与节省试剂用量，高效和环保优势明显[13]。

在色素前处理方法中，目前有关含赤藓红样品的前处理方法有液—液萃取法[14]和固相萃取法[15-16]。GB 5009.35—2016对含赤藓红样品单独标明了液—液萃取法的前处理方法，其提取步骤多、试剂多，操作繁琐，且加标回收也有较大损失，不适合大批量样品的处理[11]。研究拟探求饮料样品中赤藓红色素的简便前处理方法，并采用超高效液相色谱法(UPLC)缩短仪器检测时间，提高分离度、灵敏度，建立快速测定饮料中赤藓红色素的方法，旨在为饮料中赤藓红色素的大批量准确检测提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

超高效液相色谱仪：H-Class型，美国Waters公司；

超纯水处理仪：Milli-Q型，法国Millipore公司；

电子天平：MCE225S型，德国Sartorius公司；

pH计：PH211型，意大利Hanna公司。

1.1.2 试剂

甲醇、乙腈：色谱级，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

乙酸铵：分析级，国药集团化学试剂有限公司；

乙酸、氨水：色谱级，美国Sigma-Aldrich公司；

赤藓红标准溶液：GBW(E)100191-19002，103 μg/mL，中国计量科学研究院。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，柱温40 ℃，流速0.3 mL/min，进样量5 μL，二极管阵列检测器，检测波长530 nm，流动相为乙腈—乙酸铵(0.02 mol/L，pH 6.25)，以保留时间和光谱图定性，以峰面积定量。

1.2.2 标准系列配制 分别准确吸取质量浓度为103 μg/mL 的赤藓红标准溶液0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mL，至5个10 mL洁净容量瓶中，用超纯水定容得到赤藓红标准溶液，质量浓度分别为1.03，2.06，3.09，4.12，5.15 mg/L系列标准工作溶液。

1.2.3 样品前处理 移取适量饮料样品，加入氨水调节pH值至7.00，以5%乙腈溶液定容，超声提取30 min，经0.20 μm滤膜过滤，供超高效液相色谱仪测定。

1.2.4 检测波长的选择 将2.06 mg/L赤藓红标准溶液通过二极管阵列检测器在210～800 nm范围内进行全波长扫描。

1.2.5 流动相的选择 调整流动相极性，有助于促进化合物在色谱柱中的吸附洗脱能力强弱，同时改善峰形。原先使用甲醇和0.02 mol/L乙酸铵溶液作为流动相，但是赤藓红色谱峰响应较低，峰形较宽，出峰时间较晚。采用乙腈和0.02 mol/L乙酸铵溶液作为流动相，以冰乙酸调节乙酸铵溶液pH为6.25。

1.2.6 洗脱梯度 梯度条件见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件Table 1 Mobile phase gradient elution conditions

1.2.7 标准曲线绘制 取标准曲线工作溶液进行测定，进样量为5 μL。赤藓红标准溶液质量浓度分别为1.03，2.06，3.09，4.12，5.15 mg/L，以色谱峰的峰面积(y)为纵坐标，以赤藓红含量(x)为横坐标，绘制赤藓红的标准曲线图。

1.2.8 数据处理 使用Excel录入检测结果，绘制统计图表；应用配对t检验(双尾)比较方法差异，以P<0.05表示具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

由图1可知，当检测波长为530 nm时，响应值出现最大值为0.07 AU，因此选择530 nm作为赤藓红的检测波长，与刘亚梅等[17]的结果一致。

图1 赤藓红光谱图Figure 1 Spectrogram of erythrosine

2.2 流动相的选择

由图2可知，赤藓红标准溶液的一针进样检测时间为8 min，赤藓红出峰时间适宜，保留时间为4.371 min，色谱峰形对称，基线平稳，适用于检测分析。

图2 赤藓红标准溶液色谱图Figure 2 Chromatograms of standard solutions of erythrosine

2.3 标准曲线与检出限

由图3可知，赤藓红标准曲线一阶线性回归方程为y=69.072×103x+12.61×103，相关回归系数R2=0.999 5，结果表明在1.03～5.15 mg/L范围内二者线性关系良好。方法定性检出限(LOD)为0.010 3 mg/L，定量检出限(LOQ)为0.030 9 mg/L。

图3 赤藓红标准曲线Figure 3 Standard curve of erythrosine

2.4 样品超声提取时间的选择

取市售无赤藓红的饮料样品(经FAPAS检测认证的阴性样品)，加入赤藓红标准物质，用纯水溶解定容检测，样品中加标赤藓红不能检出。这是因为用纯水溶解时，赤藓红色素易吸附于管壁，加入一定比例的有机相乙腈后很容易将赤藓红溶解下来，且乙腈也是流动相的一部分，适宜作溶剂。而且上机前采用的注射式过滤器避免使用尼龙滤膜，因为其化学成分为聚酰胺，会吸附赤藓红而造成损失。

试验发现，加标样品中加入微量氨水(pH值5.56)，5%乙腈水溶液溶解，可检测到赤藓红的加标回收，但回收率较低。由图4可知，随着超声时间的延长，赤藓红加标回收率先上升后缓慢下降再急速下降，当超声提取时间为30 min时，回收率达到最大值62%。因此，确定样品超声提取的最适时间为30 min。

图4 超声提取时间对赤藓红加标回收率的影响Figure 4 Effect of ultrasonic extraction time on the spiked recovery of erythrosine

2.5 样品pH值的选择

由图5可知，随着样液pH值的增加，赤藓红加标回收率显著增大；当样品pH值为7.00时，加标回收率达到100.7%，之后加标回收率趋于平缓；当氨水调节样品pH至碱性(8.00，9.00)时，加标回收率略增，然而由于饮料由酸性变碱性，样品颜色发生较大改变(由绿色变为蓝色)，可能是由于pH值的变化造成了饮料中其他成分或色素色调的变化。最终确定样品pH值以氨水调至7.00为宜。

图5 样品pH值对加标回收率的影响Figure 5 Effect of pH of sample on the spike recovery

2.6 回收率和精密度

由表2可知，试验精密度为0.4%～3.2%，回收率为92%～109%。

表2 精密度和回收率测定结果Table 2 Results of precision and recovery

2.7 样品分析

应用试验建立的赤藓红含量测定方法对市售的6份饮料进行测定发现，网购的1份饮料样品中含有赤藓红(图6)，含量为0.034 6 g/kg，未超过GB 2760-2014规定的限量值(0.05 g/kg)，其他饮料未检出。同时采用GB 5009.35—2016进行检测，以配对t检验(双尾)法比较，结果表明两种方法无统计学差异。

图6 市售饮料中赤藓红实测色谱图Figure 6 Chromatogram of erythrosine in a commercially available beverage

3 结论

优化了饮料中合成着色剂赤藓红色素的前处理方法，建立了快速测定赤藓红含量的超高效液相色谱法。结果表明，饮料样品经氨水调节pH至7.00，以5%乙腈水溶液定容，再超声提取30 min后，过0.2 μm滤膜，可直接经UPLC进行测定，赤藓红标准曲线相关系数>0.999，加标回收率为92%～109%，RSD<3.2%，定性检出限为0.01 mg/L，定量检出限为0.03 mg/L。该方法准确性高、灵敏度高、重现性好。解决了国家标准中赤藓红色素需要经过液—液萃取前处理方法复杂的问题，并且不使用固相萃取柱，最大程度地简化了样品提取步骤，省时省力，提高了加标回收率，便于大批量饮料样品中赤藓红的处理检测，适用于食品安全法用于日常市场监督检测。后续将使用超高效液相色谱法研究饮料中多种食品合成着色剂同时测定的检测方法，以及对于复杂样品基质中赤藓红色素前处理方法的适用性研究。